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1、博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标【摘要】目的:观察博莱霉素诱导的肺纤维化模型中组织羟脯氨酸(Hyp) 及各氧化应激指标的变化，探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的作用方法: 二级SD大鼠40只，随机分为模型组与对照组，每组20只.气管内注入博莱霉素 A5(BLMA5)溶液,建立肺纤维化模型.分别于3,7,14和28 d每组随机抽出5只， 处死后取肺脏行HE, Masson染色鉴定模型并测定Hyp含量.同时分别以八木国 夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物(MDA);改良盐酸羟胺法测定组织总超氧化 物歧化酶(SOD)的酶活力;改良荧光法测定还原型谷胱甘肽(GSH)含量;荧光法测
2、定氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量.并计算GSH/GSSG值.结果:成功建立博莱霉素 诱导的肺纤维化模型.各指标在不同时间点出现变化.模型组Hyp含量于7 d 时高于对照组,28 d达到最高(P).模型组MDA含量随时间延长而增加，其中14 d 时显着高于对照组(P)，但在28 d时有下降.SOD活力在7 d, 14 d均降低,28 d 时上升.模型组GSH/GSSG在3 d, 7 d显着低于对照组(P),14 d, 28 d又回升. 结论:Hyp可作为博莱霉素诱导的肺纤维化的一个指标博莱霉素诱导的大鼠肺 纤维化伴有氧化损伤，且在不同阶段细胞内、外的氧化抗氧化出现失衡.【关键词】肺纤维化;羟脯氨
3、酸;氧化应激0引言肺纤维化是一组由多种病因所引起的肺破坏性疾病，目前的治疗方法尚 不能改善其不良的预后,加强对肺纤维化机制的研究，并在此基础上发展新的治 疗策略已成为更加迫切的现实需要.一般认为,在肺部，损伤组织及激发纤维化 的主要病理机制在于炎症和免疫反应，但是大量研究表明，氧自由基在炎症和免 疫介导的组织损伤中扮演了重要角色.故本研究通过建立博莱霉素诱导的肺纤 维化模型，观察各氧化指标在此过程中的变化,从自由基理论的角度，深入探讨氧 化抗氧化失衡在该病发生发展中的重要作用.1材料和方法材料博莱霉素A5,天津太河制药有限公司产品(批号:030305),8 mg/支.丙 二醛(MDA)标准品(
4、Merk 公司)；2Thiobarbituric acid(Merk 公司)；磷钨酸(中国 医药集团上海化学试剂公司)；盐酸羟胺(AR,天津化学试剂一厂)；氯化硝基四氮 唑蓝,NBT,NEMI(华美公司)；Triton X100(上海试剂一厂)；7210分光光度计(上 海分析仪器厂虹桥分厂)；970CRT荧光分光光度计(上海分析仪器总厂)；GL20A全 自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表离心机厂).二级SD大鼠40只，雄性，体质量180240 g,由第四军医大学实验动物 中心提供随机分为模型组与对照组，每组20只.方法制备模型以10 g/L戊巴比妥钠(10mg/kg, ip)麻醉大鼠，取仰卧固定
5、位， 常规消毒，行颈部正中切口，钝型分离暴露气管，于气管软骨环间隙穿刺注入 BLMA5生理盐水溶液 mL(5 mg/kg)，立即将动物直立并行旋转，缝合皮肤,待动物 自然清醒后置笼内常规饲养.对照组(假手术组)以等容量生理盐水(NS)注入气 管代之.模型鉴定分别于气管内滴药后第3,7,14和28日处理.每批每组随机抽 出5只，麻醉处死.剖开胸腔及颈部，分离气管和肺脏，结扎后取出肺脏,洗去血 渍,去除结缔组织，吸干水分;从气管插管至左主支气管，结扎固定.分离结扎 右主支气管后离断，取右上叶置体积分数为40 g/L甲醛中固定1 wk,行HE和 Masson 染色.肺脏羟脯氨酸(hydroxypro
6、line. Hyp)含量测定参考杨陟华等的方法， 将肺组织样品剪碎，置于磨口试管中，用6 mol/L HCl (W：V=1：4)水解(125C) 3 h后,稀释至10 mL,过滤.取滤液mL(空白管和标准管分别用蒸馏水和标准Hyp 代替)加蒸馏水到mL,充分氧化，加入mL柠檬酸缓冲液(mol/L,pH )和mL氯胺 T溶液(mol/L )后6 min,用过氯酸(mol/L, mL)终止反应(静置5 min).加入100 g/L PDMAB mL,于80C水浴中保温10 min,显色完全后，自来水(25C)冷却5 min. 最后用7210分光光度计在560 nm波长比色,测量其吸光度A值，用下式
7、计算Hyp 含量:肺组织Hyp含量(mg/g) = (XA样/A标)/m.其中,A样为样品管吸光度,A标 为标准管吸光度,m为肺重.氧化损伤指标的测定剪取左肺,称质量，按1：5加入生理盐水制备匀浆. 3000 r/min离心10 min,取上清，冻存备用.分别以八木国夫荧光法测定肺组织 脂质过氧化产物(MDA);改良盐酸羟胺法测定组织总SOD的酶活力;改良荧光法测 定还原型谷胱甘肽(GSH);荧光法测定氧化型谷胱甘肽(GSSG).并计算GSH/GSSG 值.统计学处理:数据均以xs表示.采用SPSS统计软件包进行分析，采 用成组t检验,方差不齐时用t检验.P为有显着性差异.A: Con tro
8、l groupHE X100; B: BLM groupHE X100; C: Con trol groupMasson X100; D: BLM groupMasson X100.2结果大体形态观察对照组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好.模型组3 d 未见有明显改变，而7 d见双肺有点状出血、灶状瘀斑.14 d双肺色泽暗淡，局 部见大小不等结节样改变，仍有陈旧出血点.28 d双肺呈灰白色，硬度增加，体积 缩小.表面有条索样凹沟.光镜观察对照组各观察点均未出现明显病变.模型组3d时出现炎性细 胞浸润等急性肺泡炎改变;7 d时肺泡间隔增厚，大量炎性细胞浸润，成纤维细胞 开始增多；14 d时肺泡炎
9、仍较重,纤维组织进一步增加;28 d炎症较前减轻，肺纤 维化程度加重，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据 (Fig 1).肺脏Hyp含量(Fig 2)模型组Hyp含量于7 d时高于对照组,28 d达到 最高(P).肺组织匀浆MDA含量、SOD活力、GSH/GSSG比值变化(Tab 13)各指标 在不同时间点出现变化.模型组MDA含量随时间延长而增加，其中14 d时显着高 于对照组(P)，但在28 d时有下降.SOD活力在7 d和14 d均降低,28 d时上升. 模型组GSH/GSSG在3 d和7 d显着低于对照组(P),14 d和28 d又回升.表1 两组大鼠肺组织匀浆
10、MDA含量变化(略)表2两组大鼠肺组织匀浆SOD活力变化 (略)表3两组大鼠肺组织匀浆GSH/GSSG比值变化(略)3讨论活性氧(ROS, Reactive oxygen species)如超氧阴离子及过氧化氢是 多种疾病的重要介质，包括肺纤维化.在正常的生理条件下，自由基引发的组织 损伤可被内源性抗氧化物质所抑制.然而，当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧 化物即氧化抗氧化系统失衡时,组织就会发生不可逆性损伤博莱霉素与铁离子 反应可以产生ROS从而损伤蛋白、脂质和DNA,其诱导的肺纤维化包括两个阶段. 早期的炎症阶段,大量的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润到间 质或肺泡中.在随后发生
11、的纤维化阶段，炎症细胞转移到肺部后，因被激活释放 过量的氧自由基，除直接引起肺组织的脂质过氧化，启动PF前的炎症反应，尚可 能通过激活核因子K B(NFk B)上调细胞因子的产量，间接促进纤维化的形成；同 时,肺纤维化的动物模型或患者中抗自由基的保护系统功能也有所降低.据此， 提出抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基系统的策略.本实验应用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型，观察发现7 d时肺泡炎明 显,28 d形成纤维化，且模型组28 d时羟脯氨酸含量显着高于对照组(P).主要 病变与指标都与文献一致，说明动物模型复制成功.Hyp是机体胶原蛋白的主要 成分之一,约占其氨基酸总量的13%
12、,其他除弹性蛋白含有少量Hyp(约1%)外,均 不含Hyp.因此组织中Hyp含量可作为其胶原组织代谢的重要指标11.本研究 还发现作为体内脂质过氧化指标的MDA 14 d时与对照相比较显着增高(P)，而 GSH/GSSG比值在3 d和7 d时有显着降低，其他时间组未见明显变化.对照组、 模型组总SOD活力在7 d和14 d时都有所降低.以上结果提示，肺组织氧化与抗 氧化指标在不同时间点出现不同的变化，作为细胞内最丰富的抗氧化剂,GSH在 细胞清除ROS过程中发挥关键作用，尤其在肺纤维化早期炎症阶段大量耗竭;MDA 含量和SOD活力在纤维化阶段有所变化，推测在成纤维细胞过度增殖并分泌大量 胶原的过程中,SOD可能发挥一定抑制作用.而据文献报道，胞外SOD是肺组织的 主要抗氧化剂，它分布于细胞表面及胞外基质中，对于保护肺泡细胞及抑制基质 的过度重建有重要作用11.因此,研究如何调控细胞基质细胞间氧化/抗氧化 系统的平衡等肺纤维化的发生机制，为防治肺纤维化的发生、发展提供新的思路.
