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1、正交设计优化蛹虫草液体菌种培养基的研究引言蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Link，别名北冬虫夏草、北虫草，属麦角菌目、麦角菌科、虫草属(Cordyceps)，蛹虫草是该属的模式种1。蛹虫草的宿主主要为鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等昆虫2，它是由昆虫的蛹体与子座两部分组成的复合体。昆虫的蛹冬季蛰居土里，蛹虫草的菌丝寄生其中吸收营养，最后其体内充满菌丝而死。到了夏季，自其尸体之上生出子座，形似草，夏至前后采集而得。蛹虫草的生态适应幅度大，因而在北回归线以南大多数地区均有分布，从真菌区系上看，蛹虫草是一种世界性分布的广布种，也是我国分布最广的虫草之一。蛹虫草在我国主要分
2、布在吉林、辽宁、陕西、广东、河南等地3，生于针、阔叶林或混交林地表土层中鳞翅目昆虫的蛹体上。国内外研究证实，氨基酸是蛹虫草和虫草具有补益作用的重要物质基础。蛹虫草所含的蛋白质由19种氨基酸组成，不仅含有人体必须的全部8种必需氨基酸，而且含量较高，蛹虫草所含的必需氨基酸占氨基酸总量的35.47%。目前已查明蛹虫草含有21种微量元素，其中硒、铁、锌、锰、钼、钙等有益元素含量丰富；所含维生素类物质，如VA、VB12、VE、VD3、VB1、VB6及VC等含量显著超过天然冬虫夏草。国外研究资料报道，从蛹虫草人工培养液中也分离出虫草素。另外，蛹虫草中还含有麦角甾醇、D-甘露醇、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、蛹虫草
3、多糖、生物碱等活性物质。近年来研究证明，蛹虫草所含虫草活性成分如虫草酸、虫草素、虫草多糖、超歧氧化酶(SOD)、腺苷等含量明显高于天然冬虫夏草，因此具有十分重要的营养、滋补及药用价值，被誉为是虫草属真菌中的后起之秀。蛹虫草所含虫草活性成分非常丰富，如多糖。多糖作为生命物质基础的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命活动及生理过程的调节。宾文等研究表明，多糖能够调节免疫细胞间信息的传递与感受、细胞的转化、分裂及再生等活动，具有抗炎、抗肿瘤作用2。孟兆丽等通过研究蛹虫草多糖对小鼠的特异性、非特异性免疫的影响，表明多糖对小鼠的特异性、非特异性免疫均有显著增强作用，同时多糖还能通过免疫调节，达到治疗或控
4、制肿瘤的目的；且多糖有促进SOD酶活力的作用，对延缓衰老有显著意义。孟兆丽等还用杯碟法研究了蛹虫草多糖对铜绿假单孢菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和四链球菌等的抑菌效果，表明蛹虫草多糖对金黄色葡萄球菌、四链球菌等革兰氏阳性菌的生长具有抑制作用，对铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌等革兰氏阴性菌无作用。第四军医大学药理教研室和汉中市医学科学研究所进行的急性和亚急性毒性实验，证明长期服用蛹虫草无蓄积作用，对主要器官亦无明显损害。其水浸液制剂进行的初步实验证明，其部分药理作用与冬虫夏草基本一致，主要有明显地抑制小鼠的自主活动，与戊巴比妥钠有协同催眠效应，拮抗戊四氮及咖啡因引起的惊厥以及增加氯胺酮的中枢抑制效
5、果，亦有提高小鼠耐缺氧能力的作用。说明蛹虫草有与冬虫夏草相同的镇静、催眠、抗缺氧、抗惊厥的药理作用，另蛹虫草有抗实验性心律失常作用4。第四军医大学药理教研室的实验还发现蛹虫草在小剂量时，可表现较强的抗疟活性，与氯喳作用强度相近。已有许多研究认为蛹虫草可作为冬虫夏草的替代品，其虫草素含量为冬虫夏草的数十倍。虫草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤，以及抗疲劳、抗衰老、提高人体免疫力等显著功效5。而蛹虫草是获得虫草素的主要来源。由于野生蛹虫草的生长环境不断受到破坏，资源日益贫乏，此时人们开始寻求人工培养蛹虫草的方法，以适应其有效成分的工业化生产。自20世纪50年代以来，国内外众多科研机构，开发部门投入了大量
6、的人力和物力，对蛹虫草的人工栽培技术进行了攻关研究，到80年代中期就成功实现了蛹虫草的人工栽培，从而使我国成为世界上首次利用虫蛹等为原料批量培养蛹虫草子实体的国家。经检测，人工培养蛹虫草的主要营养与药用成分均与野生蛹虫草的含量相当甚至更高。在虫草属中，蛹虫草独特的医疗保健，成为国内外真菌界、医疗界、生物界、食品界等部门多年来研究开发的重点。经过多年研究，蛹虫草已可进行规模化人工培养。人工栽培蛹虫草的基本方法是：（1）采得新鲜野生蛹虫草，从其子实体上用组织分离法培养得到菌种；（2）将菌种接种到消毒灭菌的米饭或小麦粒培养基上，能够得到与自然菌丝形态特征一致的子实体；（3）再将此菌接种到表面消毒的蚕
7、蛹体上，或人工培养基上即可。在蛹虫草的研究和培养过程中，液体菌种的应用越来越普遍6-7。用液体菌种栽培蛹虫草和用试管母种、固体原种栽培相比，菌丝长满料瓶的时间分别缩短15.1 d和9.7 d，生物转化率分别高19.3倍和5.2倍。用试管母种和固体原种栽培蛹虫草，不但菌丝生长慢、子实体产量极低，而且出菇稀疏不整齐，基本上不能收第2潮菇。用液体菌种栽培蛹虫草，不但菌丝生长快、产量高，且出菇整齐，能收2潮子实体，第2潮菇产量约占总产量的24.1%8。 综上所述，为了缩短蛹虫草生产周期，降低生产成本，需进一步加强液体菌种的研究。然而，不同浓度梯度的碳氮源培养的蛹虫草液体菌种，在性状上有何差异，使用效果
8、如何，研究报道较少。本试验对蛹虫草菌种液体培养基进行优化研究。以菌丝球数量、形态和菌丝体干重为指标，首先对培养基的碳、氮源浓度进行单因素试验，再以得到的最优碳、氮源浓度综合KH2PO4、MgSO4进行正交试验，进而得出最优液体菌种培养基配方。该研究筛选出蛹虫草液体菌种培养基最佳碳源和氮源以及最佳配方具有一定的理论与实际意义9。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试菌种蛹虫草菌种1.1.2 药品与试剂 马铃薯，葡萄糖，蛋白胨，琼脂，磷酸二氢钾，硫酸镁等。1.1.3 培养基斜面种子培养基：采用PDA培养基。马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，水1000 mL ，p
9、H自然。种子平板培养基：同斜面种子培养基液体基础培养基10.：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO4 2.0 g/L ，MgSO4 1.0 g/L，水1000 mL。1.1.4 主要仪器设备JA5002 电子天平 上海精密电子仪器有限公司 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅 山东新华医疗器械厂超净工作台 苏州安泰公司制造HHB11电热恒温培养箱 天津三水科学仪器有限公司ZHWY-2102型摇床 上海智诚分析仪器制造有限司循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司HHB11-600S型电热恒温干燥箱 天津市华北仪器有限公司1.2 方法1.2.1 菌种活化称取200 g马铃薯，洗净去皮切
10、碎，加水1000 ml煮沸15-20 min，用4-6层纱布过滤，再加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热分装到试管中，每支试管约分装10 mL。然后用双层报纸封口，捆扎成把后用高压灭菌锅灭菌。灭菌过程中，当压力升至于0.05 Mpa排两次冷空气，然后再121温度下灭菌30 min。灭菌结束后，当压力回到0时，取出摆放斜面，充分冷却后置于通风干燥处备用。在超净工作台上进行接种，用接种钩从原始菌种斜面中取一块约6 mm见方的菌种块，转入另一支斜面试管中，置于25 培养箱中培养，待菌丝长满斜面后备用。1.2.2 菌种同步制取PDA平板培养基，当平板内培养基凝固后，在无菌条件下将活化后的蛹
11、虫草斜面菌种接种到PDA平板中央，每皿接种1块直径约6 mm的菌种块，置于25 恒温培养箱中培养，待菌丝长满平皿后备用。菌种同步的目的是为了保证接种时接种量和种子菌龄趋于一致，最大限度地减少实验误差。1.2.3 液体培养基制备 1.2.3.1 碳源实验根据文献报道及前期工作，葡萄糖是蛹虫草菌丝生长的最适碳源。本试验主要进行不同葡萄糖浓度对菌丝生长的研究。在基础培养基的基础上，维持氮源蛋白胨浓度10 g/L和无机盐浓度不变，试验设9个处理，即葡萄糖浓度依次为0、5、10、15、20、25、30、35和40 g/L，分别标注为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。每处理3个重复。每
12、个250 mL瓶装液量100 mL。培养基配方见表1。表1 碳源培养基配方 （单位：g/L）试验次数123456789葡萄糖浓度05101520253035401.2.3.2 氮源实验根据文献报道及前期工作，蛋白胨是蛹虫草菌丝生长的最适氮源。本试验主要进行不同蛋白胨浓度对菌丝生长的研究。在基础培养基的基础上，维持碳源葡萄糖浓度20 g/L和无机盐浓度不变，试验设9个处理，即蛋白胨浓度依次为0、2、4、6、8、10、12、14、16 g/L，分别标注为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9。每处理3个重复。每个250 mL瓶装液量100 mL。培养基配方见表2。表2 氮源培养基配方
13、 （单位：g/L）试验次数123456789蛋白胨浓度02468101214161.2.4 接种待菌丝长满培养皿时，在超净工作台上，用无菌打孔器沿菌落边缘半径相同处取直径约6 mm的菌种块，用接种钩将菌种块接种到三角瓶中，每瓶接4个菌种块。用打孔器的目的是保证每瓶的接种量一致。接种过程中严格按照无菌操作规程进行操作。1.2.5 摇床培养接种后把报纸取下，只保留八层纱布，首先在26 恒温箱中静置培养24小时，以利于菌种萌发。然后置于恒温摇床中进行振荡培养。培养条件为温度26 ，转速150 r/min。48 h以后每天观察菌丝的生长状况。培养5 d后测菌丝体干重。1.2.6 蛹虫草液体菌种数量、大
14、小测定11-12 振荡培养的培养液，24 h后开始产生菌丝球，48 h后每天观测记录菌丝球大小及数量。测量方法：将培养液混匀后，用口径较大的移液管移取一定量的培养液于干净的平板上，观察菌丝球的形态并记录菌丝球的数量和直径，测量时重复3次求平均值。1.2.7 蛹虫草菌丝体干重的测定1.2.7.1 菌丝体的提取工艺发酵醪真空抽滤菌丝体干燥在真空抽滤机上放上干净的滤布，开启抽滤机，将发酵醪倒在滤布上进行抽滤。然后用蒸馏水冲洗3遍，抽滤至不滴水即可，将菌丝体刮移至在已烘干和称重的培养皿上。 1.2.7.2 菌丝体干重的测定13 先将烘干的平板称取重量mL，将分离出的菌丝体放入平板中，于干燥箱中进行烘干
15、，起始温度为35 ，每隔1 h升高5 ，最高温度不超过50 。烘干过程中每隔4 h翻动1次，烘至恒重，冷却称重，记为m2并按照下述公式计算菌丝体干重。菌丝体干重（g/100 mL）= m2（g）-m1（g）1.2.8 液体培养基最佳配方的筛选试验根据碳、氮源单因素筛选试验结果和菌丝球大小及数量的测定结果，以选出的最适葡萄糖浓度和氮源蛋白胨浓度以及无机盐KH2PO4和MgSO4为试验因素，设计L9 （34）正交试验，正交试验因素及水平见表3，配制9种培养基，每组试验设3次重复。以菌丝生物量为检测指标，取平均值，筛选出蛹虫草菌种液体培养基最适配方。表3 L9（34）正交试验因素及水平水平因素A/葡萄糖B/蛋白胨C/ MgSO4（g/L）D/KH2PO4(g/L)1110.51.02221.02.03331.53.02 结果与分析2.1不同碳氮源浓度对蛹虫草菌丝球大小
