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1、现代化学前言题目：高效毛细管电泳在药物分析中的应用 姓名：刘 传 水学号：1200800717专业：分析化学导师：曹秋娥教授学院：化学科学与工程学院高效毛细管电泳在药物分析中的应用摘 要：高效毛细管电泳技术是近年来发展迅速的一种新型分析技术，具有高效、快速、分离模式多、 应用范围广等特点。本文主要对对高效毛细管电泳(HPCE)技术的特点和仪器结构作简要介绍，概括 综述了高效毛细管电泳技术近年来在药物分析领域的应用。关键词：高效毛细管电泳； 药物分析； 应用高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis； HPCE)又称为毛细管电泳 (CE)
2、,是指以高压电场为驱动力，以毛细管作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和 分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，具有色谱和电泳两种分离机制1高 效毛细管电泳技术包括在毛细管中进行的自由溶液区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis; CZE)、等速电泳(Capillary Isotachophoresis; CITP)、等速电泳凝胶电泳 (Capillacy Gel Electrophoresis; CGE)等电聚焦电泳(Capillary Isoelectric focusinn; CIEF)以 及电泳与色谱法相结合的毛细管胶束电色谱 ( Micella
3、r Electrokinetic chromatonraphy; MEKCO)和毛细管电色谱(Capillary Electrochromatonraphy; CEC)本文简要介绍 HPCE 的 基本概况和在药物分析中的广泛应用。随着药物研究与发展战略的进程，药物分析和药物质量控制己成为制约战略发展的 首要问题，药物分析和质量控制己采用以仪器分析为主的分析技术。高效毛细管电泳技术的应用范围十分广泛，可分离无机离子、小分子有机物、氨基 酸，肽、蛋自质、核苷酸及药物等药品有效成分有其特殊复杂性，尤其是中药，首先是 中药品种繁多，不同品种间活性成分含量相差大，其次，中药中有效成分还受产地、栽 培、生
4、长环境和采收季节等多种因素影响至于有多种中药组成的复方制剂，其情况就更 为复杂目前用于药物分析的方法有薄层色谱法、气相色谱法, 高效液相色谱法等，其中 高效液相色谱法最为常用，但药物成分复杂繁多，难以完全精制，在应用高效液相色谱 法分析药物有效成分时，常常会遇到一些问题，如分析时间长，分离效率低，即使采用 梯度洗脱技术也难以达到完全分离此外，色谱柱容易受污染，污染后难以清洗而高效毛 细管电泳技术以其高效、快速、进样体积小、溶剂消耗小和抗污染能力强等特点在药物 有效成分分析方面显示出一定优势。1 HPCEHPCE技术最旱可追溯到1808年俄国物理学家Von Rucss首次发现的电泳现象，其 理论
5、则可追溯到1897年Kohlrausch首次提出离子迁移方程1981年Jorgenson和Lukacs 用内径75 “m的石英毛细管对荧光标识氨基酸化合物进行CE测定，以荧光检测器做在 线检测，获得理论塔板数高达 40 万的高分离性能，标志着现代毛细管电泳技术的创立 1988 年、1989年出现了第一批商品毛细管电泳仪器。至今，国内外毛细管电泳在理论、 技术、仪器和应用等各方面的研究都非常活跃2。1.1 特点与高效液相色谱(H PLC )相比，HPCE具有高灵敏度、高分辨率、高速度、样品少、 成本少、应用范围广的特点。HPCE常用紫外检测器的检测限可达10-1510-i3mo1L-i 激光诱导
6、荧光检测器则达10-21 10-19 mo1L-i L而HPLC的检测限多在10-1210-9 mo1L-i 的范围；HPCE理论柱效极高，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至千万， 而HPLC 一般为几千到几万；分析时间短，通常(3 0min,般在几分钟内完成，有的约 1 m in完成，最快可在几十秒内完成，而H PLC的分析时间则多为0.051.00h，所需样 品很少，只需毫微升的用量(10 -9L)；在分析过程中，由于样品不需进行前处理或只需作 简单预处理，并只需要少量的流动相和价格低廉的毛细管。毛细管柱易于清洗可重复利 用使成本降低特别适合于药物的化学分析由于分离模式可供选择，
7、HPC E的应用范围 较广，毛细管区带电泳(CZE )多用于对带电物质的分离分析，如蛋白质、氨基酸、多肽、 对映体和离子等:毛细管胶束电动色谱(MEKC /MECC)适合于中性物质的分离，可用于 氨基酸肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的分析:毛细管等速电泳(CITP) 常用于分离离子型物质，如有机酸：毛细管等电聚焦电泳(CIEF)常用于具兼性离子的样 品，如蛋白质、肽类等：毛细管凝胶电泳(CGE)适用于生物大分子的分析，如蛋白质、 寡聚核苷酸、RNA、DNA，还可用于聚合酶链式反应(PCR)产物分析。1.2 仪器结构仪器结构 基本结构大致包括：毛细管柱、进样系统、高压系统、检测系
8、统和数据 收集系统等2。毛细管柱是HPCE的核心部件，石英毛细管是当今的首选材料，聚四氟乙烯是毛细 管的另一种材料。最常用的毛细管内径为20- 75 pm,有效长度为50- 75 cm进样系统采用 自动进样方式，主要有流体力学和电动方式。高压系统要能提供30 kV的自流电压和200 - 300 pA 的电流，电源最好使用双极性电源。检测器目前最常用的是紫外可见光检测器和荧光检测器 (包括普通荧光和激光诱导 荧光)紫外可见分光检测器分为固定波长或可变波长检测器及二极管阵列(DAD)或波长 扫描检测器两类。前者一灵敏度高于后者，而后者能提供时间-波长-吸光度三维图谱， 用来定性、鉴别未知物及在线峰
9、纯度检查荧光法灵敏度一般可比紫外检测器高 104 105 倍。激光诱导荧光检测器是目前最灵敏的检测器，已达到光谱分析方法的极限 -单原子 和单分子检测6。2 药物分析中的作用2.1 在中药分析中的应用高效毛细管电泳技术首先应用于生物碱、黄酮苷类成分的分析，继而推广到香豆素 类、强心苷类、皂苷类、有机酚酸类等非挥发性成分分析。从九十年代以来，日本和我 国台湾、香港地区学者应用高效毛细管电泳技术开展中药化学成分分析研究，涉及多种 药材活性成分，并在此基础上对这些药材有关的几十种中药复方制剂进行定量分析1， 均认为高效毛细管电泳技术具有高效、快捷、微量、可自动化等特点，对成分复杂的中 药、特别是中药
10、复方的大样品量分析尤为有用。近几年以来，探讨利用高效液相色谱技 术的优点来解决中药所含有效成分或特征性成分的分析困难已引起学者一们的重视。传统凝胶电泳技术虽已用于动物类、果实种子类等许多中药材的定性鉴别，但因分 辨率低，操作繁琐，重现性差而难以推广，高效毛细管电泳技术快速高效、操作简便， 并可以进一步定量化，李绍平等人运用高效毛细管电泳技术测定冬虫夏草中核苷酸的含 量取得了良好的结果7。运用高效毛细管电泳技术鉴别酸枣仁及其混淆品中蛋白质8。 枸杞子中的蛋白多肽9都有不错的效果同时有人利用毛细管技术测定了药物中的硒10。HPCE 因其特别适宜快速大量地分析复杂的中药成分而被广泛用于中成药和中药制
11、 剂的分析中1993年L iu等11首次将CE法应用于中药复方制剂的分析中，对清脾汤、 小青龙汤、桂茂芍药知母汤、大青龙汤、停喘汤、防风通圣散、华盖散等 19 种中药制 剂中的麻黄碱和伪麻黄碱的含量:进行了测定。此后对中成药和中药复方制剂的研究还包 括柴胡汤、小柴胡汤、三黄泻心汤、芍药汤等汤剂，变通丸、香连丸、二妙丸、白带丸、 牛黄上清丸、黄连上清丸、朱砂安神丸和甘露散等丸散剂中有效成分的分离测定。近年 来，韩凤梅等12建立了清开灵口服液和双黄连口服液中黄苓苷定量分析的HPCE法。张 艳等13采用胶束电动毛细管电泳法测定了瞿黄液中大黄素、大黄酚、大黄酸和大黄素甲 醚的含量许重远等14建立了甘草
12、栓中日草酸、甘草次酸的高效毛细管电泳法，为中药甘 草制剂的质量控制提供新的检测方法。体内各种药物的HPCE法分析在体内药物分析中，常见的样品有血浆、血清、尿液和头发等，为避免样品中的蛋 白质和盐等基质对分析测定的干扰，常需对样品进行预处理 HPCE 对样品的预处理要 求，没有HPLC和GC那么严格。常用的预处理方法有沉淀法和萃取法当待测物浓度足 够大时，可离心进样或经简单离心过滤后进样若样品中含盐和蛋白质，可用在柱微渗析 或小孔聚丙烯酰胺凝胶将待测物与上述基质分离，待测物分子较小且与高浓度蛋白质混 合时，可用超滤法或排阻色谱法分离。萃取法主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE), 这2种
13、萃取方法都是基于待测物质在两相之间分配行为的差异，都适用于基质干扰较大， 待测组分数量较多，尤其是含脂溶性成分较多的样品。化学药物在HPCE应用方面最为广泛，阿昔洛韦、加巴喷丁16、华法林17等在体 液中都达到较好的检测目的.在优化色谱条件时，常加入有机溶剂添加剂如二丙醇、甲醇， 以改善待测组分的分离；加入手性添加剂以适用手性药物的分离。将 HPCE 用于滥用药物分析，在毒品检验、戒毒工作方面有独特的优势，有些吸毒 者虽然在短期内停止吸毒，在尿样或血清中检测不出毒品，但对于它们头发中痕量 18 可卡因、吗啡仍可用CZE检测出，以确定其有无吸毒史。体液中抗菌药物浓度的测定传统上采用微生物法，虽然
14、具有设备简单，样品无需预 处理等优点但专属性较差，只能测定出抗菌药物的总效价而不能区分出抗菌药物的活性 代谢物，而HPCE可以克服上述缺点，而且分离效率较高。对手性分子对映体药物的分离常用的200多种药物中，一半以上至少具有1个手性中心，而这些药物中的75%一 90是以外消旋体形式在市场销售，为了准确了解这些药的药效和交全性，有必要对手 性药物的各个异构体进行分离并分别考察各自的生理活性；另外需要注意的是一些非手 性药物，如抗精神病药物氟哌啶醇和抗癫痫药物苯妥因等，因为它们的体内代谢物都是 手性的，因此也存在立体选择性代谢问题。对手性药物的各个异构体进行分离，能更好 地了解药效和交全用药，制定
15、合理的给药方案，为剂量调整提供科学依据。手性分子对 映体药物拆分技术是在背景手性分子对映体药物拆分技术是在背景电解质加入手性选 择试剂,如环糊精、冠醚等。这些大分子添加有明显的立体选择性，能与对映体形成络合 物而被分离。高效毛细管电泳法拆分布洛芬对应体异构体ML以20mmol/L,硫酸盐，为运 行缓冲液（PH= 7. 1）, n50l/L,伕CD和30mmol/L.去氧胆酸钠（SDC）为手性选择试剂， 石英毛细管柱47cmx75“m级管阵列检测器,214 nm处检测，运行电压12 kV温度23C, 布洛芬的加样回收率分别为97. 8%和Q 101. 4%, RSD分别为0. 14%和0. 26
16、%手性药物对映体的高效毛细管电泳拆分有多种分离模式，如毛细管区带电泳（CZE） 胶束电动毛细管色谱（MEKC），毛细管凝胶电泳（CGE）等20。细管区带电泳是毛细管电 泳中最基本的种,无需固体介质支持,因而不存在基质效应,能分离强度差别较小的 组分其用于分离手性药物的机理为在缓冲液中加入手性试剂,依据药物对映体与手性试 剂形成的结合物的络合常数不同,造成表现迁移率的差异而分离。常用的手性添加剂以 环糊精及其衍生物应用较多21如Filie以宓环糊精作为手性选择剂分离一系列酸性药 物，而Stalcu则使用了高硫酸盐环糊精。环糊精（CD）是一类环形寡聚糖，根据分子中葡萄糖单元个数的不同，可分为a R Y三类，它们分别为6、7、8个D-吡喃葡萄糖含手性碳原子）通过a1,4羟基连在一起的 环状化合物,其内部具有直径不等的内腔,空腔内部为疏水性,外部有羟基,具有亲
