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1、果蝇杂交实验计划书生技08-1组员：刘晓瑜 080414113 侯交弟080414118 刘越 080414112 胡亚云 080414114一、实验目的通过观察具一对相对性状差异的亲本杂交，其F2代表现得分离现象，验证分离定律的存在；通过观察具两对相对性状差异的亲本杂交，其F2代表现得分离现象，验证自由组合定律的存在；验证伴性遗传规律，伴性基因与常染色体上等位基因分离定律想比较时，进一步理解两者之间的区别与联系。1、通过实验掌握果蝇的杂交实验2、验证和加深理解遗传定律的原理：分离定律自由组合定律伴性遗传规律绘制遗传图的原理3、记录实验结果，掌握统计处理的方法及求重组值的方法、绘制遗传图的方法
2、二、实验原理及设计果蝇的染色体：选取雄性黑檀体果蝇（eeX+Y）和雌性三隐性果蝇（EEXWXW）作为亲本。其中雄性为黑檀体、长翅、红眼和直刚毛；雌性为灰体、小翅、白眼和卷刚毛。获得F1代进行自交，统计F2代性状及雌雄，数量等等，记录。控制红眼、长翅、直刚毛这三个形状的基因在X染色体上，控制体色的基因在常染色体上，用EE或ee表示其基因型。黑檀体果蝇是野生型果蝇的突变体，即体色由灰色转变为黑色，其余形状没有改变。三隐形突变体形状为白眼、小翅和卷刚毛，用XwXw表示。显性性状为红眼、长翅和直刚毛，用X+Y表示。且白眼、小翅、卷刚毛这三个基因位于X染色体上连锁。因此黑檀体雄性果蝇基因型为eeX+Y，
3、雌性三隐性果蝇为EEXwXw。孟德尔分离定律：具一对相对性状差异的亲本杂交（单因子杂交），F1代为一对基因的杂合体，它们表现显性性状。杂合体中来自父本雄性生殖细胞和母本雌性生殖细胞的等位基因相互银行独立，在形成配子过程中，它们相互分离，分别进入到不同的配子中 ，从而产生两种类型不同、数目相等的配子（不同配子的比例为1:1）, F1自交或互交时，由于雌雄配子的随机结合，F2代基因型比例为1:2:1，在显性完全时，表型分离比例为3:1孟德尔自由组合定律：具两对或两对以上相对性状差异的亲本杂交（双因子或多因子杂交），F1代形成多对基因的杂合体，它们表现多种显性性状，F1代杂合体形成配子的过程中，一对
4、等位基因按分离定律的彼此分离与另一结（或几对）等位基因的彼此分离是相互独立的，即不同对的等位基因是以自由组合的方式进入配子的。这样两对基因的杂合体可产生四种类型不同、数目相等的配子（四种类型的配子比例为1:1:1:1）,F1自交或互交时，由于精子、卵子的随机组合，F2产生九种基因型，若显性完全则出现四种表现型，它们的比例为9:3:3:1摩尔根通过试验，提出了伴性遗传规律即：位于性染色体上的基因所控制的性状，伴随性别传递给后代。摩尔根通过伴性遗传实验，第一次把一个特定的基因（控制白眼的基因）定位在一条特定的染色体（X染色体）上。连锁互换定律：同源染色体上非等位基因间交换重组重组值（RF）=重组型
5、数目（亲组型数目+重组型数目）100%三点测交：位于同一条染色体上的基因称为连锁基因。同源染色体上的连锁基因之间会发生一定频率的交换，在子代中出现一定数量的重组型。重组型子代的多少反映出基因间发生交换的频率的高低。基因在染色体上是呈直线排列的，基因间距离越远，发生交换的可能性就越大，反之亦然。连锁基因间的距离与重组值的大小有关，则根据重组值可确定基因在染色体上的位置和排列顺序，从而作出连锁图。具体如下：1、果蝇的单因子杂交实验黑檀体与灰体P 黑体（ee）X灰体（EE）F1 灰体（Ee）2、果蝇的双因子杂交实验黑檀体正常翅果蝇与灰体小翅果蝇P灰体小翅（）（EExmxm）黑檀体长翅（）（eex+y
6、） F1：灰体长翅(Eex+xm) 灰体小翅（Eexmy） F2：Exm1/4Ex+1/4exm1/4ex+1/4 Exm1/4 1/161/161/161/16 exm1/4 1/161/161/161/16 Ey1/4 1/161/161/161/16 ey1/4 1/161/161/161/16 灰体长翅：灰体小翅：黑体长翅：黑体小翅=3：3：1：1野生型果蝇与三隐性果蝇3、果蝇的伴性遗传杂交实验伴性遗传实验：反交 P xwxw(白眼) x+y(红眼) F1 x+xw xwy (红眼) （白眼）F2 x+xw xwxw x+y xwy (红眼) （白眼） （红眼） （白眼）4、果蝇的三点
7、测交实验果蝇的三点测验的基因定位方法：（1） 三对基因杂合体的获得，以三隐性（白眼、小翅、卷刚毛）雌蝇与黑檀体（红眼、长翅、直刚毛）雄蝇进行杂交，得到三对基因的杂合体。 P w m sn3 + + + w m sn3 F1 w m sn3 w m sn3+ + + + + +(2) 测交：将三对基因杂合体自交,后代可获得8种类型的果蝇，下面以一组实验数据为例来进行白眼、小翅及卷刚毛三个基因的定位，统计后代雄性果蝇。F2代表型有：白眼 小翅 卷刚毛 470 红眼 小翅 直刚毛 112红眼 长翅 直刚毛 464 白眼 长翅 卷刚毛 71白眼 长翅 直刚毛 149 白眼 小翅 直刚毛 10红眼 小翅
8、 卷刚毛 131 红眼 长翅 卷刚毛 14根据子二代的性状和数据，可知白眼、小翅、卷刚毛和红眼、长翅、直刚毛两种亲本类型的个体数量多;白眼、小翅、直刚毛和红眼、长翅、卷刚毛两种子代类型个体数最少，为双交换类型。将亲本型与双交换型进行比较，哪个性状发生了变化，则决定该性状的基因一定居于另两个基因之间。在本实验中，控制刚毛的sn3的基因发生了变化，因此可以肯定决定刚毛性状的基因居中，所以三个基因的顺序应为： w sn3 m(3) 将以上的杂交结果进行整理并计算交换值： w sn3 m 470 65.7% 亲本型+ + + 464w + + 149 19.7% 单交换+ sn3 + 131w sn3
9、 + 71 12.9% 单交换+ + m 112w + m 10 1.7% 双交换+ sn3 + 14重组值的计算和基因作图：w-sn3的重组值=19.7%+1.7%=21.4%sn3-m的重组值=12.9%+1.7%=14.6%w-m的重组值=19.7%+12.9%+21.7%+36.0%根据所得重组值，得出三个基因的顺序和图距如下： w 21.4 sn3 14.6 m三、果蝇生活史观察：果蝇是完全变态昆虫，生活周期可分为4个时期：卵、幼虫、蛹和成虫。卵：羽化后的雌蝇一般在12小时后开始交配，两天后产卵。卵为白色，椭圆形，长约0.5mm，在背面的前端伸出一触丝，附着在食物上。幼虫：从卵孵化出
10、来后，经过两次蜕皮，发育成三龄幼虫，此时体长可达45cmm.肉眼可见其尖端稍尖部分为头部，上有一黑色斑点为口器。口器后面有一对透明的唾液腺,透过提笔可见到一对生殖腺位于躯体后半部上方的两侧,精巢较大,外观上是一明显的黑点,而卵巢则较小,可以此作为鉴别.幼虫活动力强而贪食,他们在培养基上牌兴时,留下很多条沟,够多而且宽时,表明幼虫生长力良好。蛹：幼虫生活7-8天准备化蛹，化蛹前三龄幼虫停止摄食，爬到相对干燥的瓶壁上，逐渐形成一梭形的蛹，在蛹前部有两个呼吸孔，喉部有尾芽，起初蛹壳颜色淡黄而柔软，以后逐渐硬化为深褐色，表明即将羽化了。成虫：幼虫在蛹壳内完成成虫体型和器官的分化，最后从蛹壳前爬出。刚从
11、蛹壳里羽化出来的虫体肥大，翅膀未展开，体表没有完全几丁质化，故称半透明的入白色，不久，变为短促圆形，双翅展开。体色加深。如果是野生型，起初为浅灰色，然后呈灰褐色。果蝇的最适培养温度为20-25度，在25度的条件下，从卵发育到成虫需十天左右，羽化后的成虫寿命一般在四周左右，羽化12小时即可进行交配，2天后可以开始产卵。雌蝇体内有储精囊，做杂交实验时，需要先将雌蝇和雄蝇分开。可以想用乙醚将果蝇麻醉之后，根据雌雄蝇的不同特征将它们分开。雄蝇的前肢附节上有性梳，雌性没有；雌性的腹部背面有五条黑纹，雄性的腹部背面有三条黑纹，最后一条极宽并延续至腹面腹部。四、实验用品 1材料：三隐性突变型品系：雌蝇（ws
12、n3m/wsn3m）和雄蝇（wsn3m/Y），黑檀体长翅（eeVgVg）2器材和仪器：隔水式恒温培养箱，体式显微镜或普通光学显微镜，放大镜，麻醉瓶、双目解剖镜、恒温箱、高压灭菌锅、天平、培养瓶、白瓷板、镊子、纱布、 吸水纸、牛皮纸、毛笔、油性笔、不干胶标签、载玻片、盖玻片。 3试剂：琼脂，白糖或蔗糖，玉米粉，酵母（新鲜或干粉），苯甲酸，丙酸，乙醚，70%酒精，蒸馏水。五、实验步骤 1、分别取部分三隐性果蝇和黑檀体果蝇，麻醉，从中挑出雌性三隐性和雄性黑檀体处女蝇各5只，放入一号瓶中进行杂交，并在瓶上做标签。（4人共同负责）2、果蝇在瓶中交配，交配后大约40小时开始产卵，即第2天开始产卵，至第4、
13、5天时出现产卵高峰。观察并记录果蝇的交配、产卵及其他特征性行为。（胡亚云和刘晓瑜一组，刘越和侯交弟一组，每次按组轮流观察）3、F1代经大约10天时间由蛹孵出变为成虫，其间蛹变色时（未有F1代成虫孵出时）将亲代果蝇移出处死。观察并详细记录果蝇由卵经一龄幼虫，两次蜕皮后成蛹，至羽化的全过程。（刘越和侯交弟一组，胡亚云和刘晓瑜一组，每次按组轮流观察）4、在新产生的F1代果蝇成虫中选取20对移入2号瓶中。转移时对果蝇雌雄，性状及数量进行详细记录。1号瓶中的F1代果蝇完全羽化后，对所剩果蝇做统计，记录雌雄，性状及数量，然后移出处死。（四人全部负责）5、2号瓶中F1代果蝇开始杂交，得F2代。重复第2、3步骤，观察并及时处理F1代果蝇。（刘越和侯交弟一组，胡亚云和刘晓瑜一组，每次按组轮流观察）6、洗净1号瓶，从发现F2代羽化后每天三次观察将新羽化出的F2代移入1号瓶中，同时统计移出的F2代果蝇雌雄的数目，各个性状及数量。重复该步骤至多10天（保证无F3代产生），直到对所有F2代都做
