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1、生物物理技术综述#生物物理技术综述荧 光 光 谱(Fluoresce nee Spectroscopy) 韩荣成(10303023)北京大学,03级生物医学工程一、背景知识：1. 荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸 收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有 红外荧光、X射线荧光等。在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。但是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E=Ee+Ev+Er，其中Ee：价电子运动能(electron);Ev :原子在平衡
2、位置的振动能( vibration)； Er：分子绕其重心的转动能(rotation )。Ee大 约为1eV数量级；Ev大约为10102 eV ； Er大约为104105eV数量级，可见Ee Ev Er2, 分了 的能级Energy Levels与跃迁TransitionexcitedstateInterualconveIntersvstemHi1crossingexcitedrsinstateIllifluorescence系间窜越IVPhospho-Quen- ebing级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光(fluorescenee ),发生在10_9s内；如果以
3、非辐射的形式丢失能量则称为淬灭(quenching)。如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。磷光产生的机制与荧光是不同的， 虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子 直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动 能级的另一种亚稳能级？三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的 光。所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1 即原来两个配对的自旋 方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。处于第一电子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐
4、射跃迁（系间交连，in tersystem crossing）消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线 态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于 三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这样， 在三线态停留的时间即寿命就比较长（从 10-3秒到数秒），强度很弱。由于三线态能 量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。、荧光光谱:激发光谱发射光谱IIII荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作 用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效 率；
5、发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况， 也就是荧光中不同波长的光 成分的相对强度。Eniission spectrumexcitation spectrum:IIiiiiii；IIAeitk激发谱既然是表示某种荧光 物质在不同波长的激发光作 用下所测得的同一波长下荧 光强度的变化，而荧光的产生 又与吸收有关，因此激发谱和 吸收谱极为相似，呈正相关。 由于激发态和基态有相似的 振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低 振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关 系.入 ex： m
6、aximum excitation wavelength; 入 em（入 ax）： maximum emissio n wavele ngth2. 荧光光谱仪和主要谱参数2.1荧光光谱仪荧光谱仪结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。1光源：现在多用氙灯，氙灯在 200-800nm范围内具较好的发射谱。2. 入射光单色器：入射光单色器是用来选择特定波长的单色光，入射到样品上。荧光分光度计 中采用光栅作为单色器。激发波长择描就是靠它来改变波长。3. 监视探测器：这个探测器用来监测光源的恒定性。4. 光闸：光闸关闭时，入射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防止样品长期受到照射而产 生化
7、分解。另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防止读数过大，给图笔撞击端部。5. 样品杯：样品杯是 10mm x 10mm的石英杯，四面透明，且用去荧光石英材料制成。注意荧 光样品杯不能用紫外谱仪中的样品杯代替。6. 发射光单色器：用来选择一定波长的光进入探测器测量。发射光择描就是用它来实现的。7. 计算机辅助记录系统：用以完成绘图及荧光强度的测量。荧光光谱仪与主要谱参量n仪器原理及结构#生物物理技术综述#生物物理技术综述发射波长单色器检测器输出.控制、数#生物物理技术综述#生物物理技术综述2.2主要的谱参数2.2.1 荧光寿命(fluorescenee lifetime)1/e所需要的时间，
8、称为荧光去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的 寿命，常用T表示：T=/k( 1)-kt证明：11 =I oe其中I 0是激发时最大荧光强度，It是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时 T寸测得 的It为I 0的1/e,贝U 是我们定义的荧光寿命。It =-Ioe则有：T=/k如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比，速 率常数即为单位时间中发射的光子数，因此有t=1/Kf。Kf是速率常 数。t表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射过程的衰减常数。如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程 (如淬灭和能量转移)，则寿命 还和这些过程的
9、速率常数有关，结果是荧光寿命降低。由于吸收 几率与发射几率有关，T与摩尔消光系数amax (单位为cm2mol-1或(mol dm-3) -1 cm-1)也就密切相关,从下式可以得到t的粗略估计值(单位为秒)。1/ T & 10 Snax在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数， 而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学 方面的信息。2. 2.2 荧光量子产率(quantum yield):荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的本领。荧光量子产率通常用$ 来表示，定义为发射量子数和吸收量
10、子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。=发出量子数/吸收量子数。处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程回到基态。其结果是加快 了激发态分子回到基态的过程 (或称退激过程)。0= T T证明：总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示k=kF+ Ekiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿命T为：T=/k=1/(kF+ Eki)因此，量子产率又可以表示为如 Kf + EikiKf因为 1/k F=T , T=/(kF+ Ei)所以$=Tt册勺绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修
11、正因子。实际测量中大 多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。证明：对稀溶液来说，荧光强度F与吸收度A成正比：F=kIoA?这里k是比例常数，Io是吸收前的光强度，$是荧光量子产率。若两种溶液测量条件完全相同，则：(quenching),如温度淬灭，杂质F1/F2=A 1 $1/(A2$2) ()1/()2=F 1A2/(F 2A1) 已知$2就可求出$1。由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会 引起荧光强度的改变。因此，如果只要研究量子产率的相对值，只要量测荧光强度也就足够了。2
12、. 2 . 3荧光强度：荧光强度F取决于激发态的初始分布Ia与量子产率0的乘积。F =Ia$这里的F指的是向各个方 向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强 度F =IaZ,这里z是仪器因子。L和浓度C对光吸收A据据Beer-Lambert定律（A = KCL，朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度 的关系，其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质而定）|A=|o-|t=|oi-exp-2.3 （甌） C I式中（囲为激发波长处的消光系数，C为样品分子的浓度，|0为入射光强度，I。为透过样品后的光强度，I为光程（样品池光径）。对于稀溶液，吸收很稀，（冷很小-
13、 2.3 （ Aa）C I vv 1,因此,1-2.3 （Za）C Iexp（-2.3 （ H）C I）|a=|o（1-（1-2.3 （入a）C I） =2.3log（入a）C IFx=l aZ=2.3Io e（ Aa）C I ? Z如果激发光强保持不变，且？和Z与激发波长无关，则FX&加）很显然，荧光强度与样品在波度Aa处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱， 因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。 当然，实际上仪器因子 Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。2.2.4 荧光偏振（fluores
14、ce nee poIarizatio n）鶴績方向#生物物理技术综述振片后变为线偏线偏振光：光矢量 向振动的光（又称验光线的偏振化偏振片：吸收某方向光振动，而与其垂直方向的光振动能通过的装置 偏振化方向：能通过光振动的方向自然光通过偏 振光，称为起偏； 只沿一个固定方 平面偏振光）利用偏振片检 程度，称为检偏荧光偏振度P=（I /- l丄）/ （l / + l丄）荧光各向异性A= （l /- l丄）/（1/+21丄）可以证明I +2 I丄为荧光总强度,（1/P-1/3 ） -1=（2/3） APerrin 公式：1/P 1/3=(1/P o 1/3)(1+3 t / p )=(1/Pol/3)
15、(1 +RTt / nVo)其中，Po为极限偏振度，T为荧光寿命，R气体常数，T绝对温度，n为粘滞系数Vo为分子体积(按球形计算)，p旋转迟豫时间。研究大分子性质以及与小分子的相互作用。不同生理条件下生物大分子的P不同，可以借此诊断疾病。3讨论：(1)环境因素对Amax的影响：a.环境(如溶剂)的极性对 亦ax的影响-同一种荧光物质在不同极性的环境中，其Amax可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂(或极性环境)相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来 影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移这种影响的结果可以用Lippert方程来解释： -?9?
