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1、微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理,纯熟掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观测技术。理解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。2实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢060911.5微米，椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时,常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是 -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖,故名
2、。选择含淀粉丰富的土壤为最佳,度的水浴解决样品1小时,目的是杀死微生物营养体,残留芽胞。运用稀释涂步法,在淀粉的培养基培养，培养1-天后，观测。然后，进行初筛与纯化,鉴定参照伯杰氏细菌手册鉴定或者运用显微镜进行革兰氏染色，确认与否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后拟定菌株。3实验材料3.1 选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，因此应选淀粉培养基。配方：牛肉膏 0g蛋白胨 10.0g氯化钠50g可溶性淀粉 .0g琼脂2g蒸馏水 1000l调节 pH至 7.2配备时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状,再加入到融化好的培养基中。3.2 溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨2.5氯
3、化钠 .25可溶性淀粉2.5g琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾4克,可溶性淀粉克，磷酸氢二钠4523克，柠檬酸808克，氯化钴25克,重铬酸钾.34克，00毫升 0.0NHL。3.4仪器或其她用品平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、00ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。4 实验流程倒平板制备梯度稀释液涂布培养初筛复筛纯化保存 实验环节实验前准备制备淀粉培养基,无菌水,在21摄氏度下灭菌min。倒平板。把接种工具，培养基,和其
4、她用品所有在超净工作台上摆好,进行紫外线灭菌30mn。51制备土壤稀释液取土样时最佳选用如花坛等地方的土样,选好采样地点,铲产去表层5cm，取51m处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充足混合，将细胞分散。放入盛有99l无菌水三角瓶中，常压80度的水浴解决样品小时后，取出。用一支1l无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有ml无菌水的大试管中充足混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取ml加入另一盛有9l无菌水的试管中,混合均匀，以此类推,制成10-2、10-3、10-、10不同稀释度的土壤溶液
5、。.2 涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10、104、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10、0-、105三管土壤稀释液中各吸取.2m,小心地滴在相应平板培养基表面中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。室温下静置0min,使菌液浸入培养基。5.3 培养将淀粉培养基平板倒置于0C培养箱中培养1d。5.4 初筛观测菌落表面粗糙不透明,呈污白色或微黄色,将这样的菌种单个菌落分别挑取少量细胞接种到培养基上,置于30C的培养箱中培养,若发既有杂菌,需要再一次进行分离纯化。(如不能用肉眼更好的观测，可
6、对其进行革兰氏染色，在显微镜下观测,与原则菌种比较。）5.8 复筛测定其淀粉酶活。5.8. 试剂和器材1、试剂：(1）碘原液：称取碘11克，碘化钾2克，加水溶解,稀释至500毫升。（2)稀碘液:取碘原液2毫升,加碘化钾2克，稀释至0毫升，此试剂随配随用。(3）%淀粉液:称取干燥过的可溶性淀粉克，加毫升蒸馏水,搅拌混和,再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH为6)(4)柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠（Na2HP12H2）4.克,柠檬酸 （68O7HO）8.068克，加水溶解,稀释至1000毫升。(）原则比色液:称取氯化钴（CoCL26H2O
7、)25克和重铬酸钾3.34克溶于00毫升0.01N CL,其五倍稀释作原则。(）样品:细菌-淀粉酶2、器材（)电热恒温水浴 ()试管(3）量筒 （4）吸量管（1m)5.8.2 操作措施：、取试管1支，加20毫升%淀粉,混匀，在30水浴中，使管内温度达到30。2、将淀粉酶05ml加到的淀粉液中,混匀,在30水浴中保温,自加入记时,经分钟后取反映液毫升，加入盛有毫升稀碘液的试管中。混匀,目测比色,每隔一定期间反复测定,直至呈色与原则比色颜色相似为止，记录反映进行的时间。3、计算。在上述条件下,每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一种酶活力单位。5. 纯化并保存菌种保存时一般都需要不受杂
8、菌污染,菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同步,做好如下工作:(1）做好菌种保存记录,注明菌种名称,分离年月日、分离者姓名、分离地点等。（2）避免杂菌污染及意外事故，把菌种保存在23只试管中备用。(3）原始菌种妥善保存。6 成果与分析6. 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数6.枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观测鉴定成果【注明参照文献，格式参照学术论文样式】枯草芽孢杆菌的鉴定实验1、形态的观测（形状、颜色、质地、透明度等）（1)单个菌体的形态(）群体形态的观测、革兰氏染色3、芽孢染色4、菌体大小测量5、枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定:一、过氧化氢酶测定1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化
9、氢分解成水和氧2、试剂:31%过氧化氢培养基:肉汤琼脂培养基、操作环节：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上,30培养 12 天。取一干净载玻片，在上面加一滴30的过氧化氢，挑取一环培养12 天的菌苔，在过氧化氢 溶液中涂抹,若有气泡（氧气）浮现,记作过氧化氢酶阳性,无气泡者为阴性。也可将液直接加入斜面上,观测气泡的产生。 二、需氧性实验1、原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差别，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌 的一种较重要指标。 2、培养基：半固体培养基 3、操作环节：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底),一般于 3 培养 37 天观测成果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为
10、好氧菌,沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌 三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理: 本实验是测定芽孢杆菌 （或其她细菌） 发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 的胍基起作用，生成红色化合物,即表达2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰, 后者与蛋白胨中精氨酸所含 VP. 实验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基,可加速反映。反映式如下: 2丙酮酸乙酰甲基甲醇 + 2二氧化碳； -2H乙酰甲基甲醇 二乙酰; +KO 缩合 二乙酰 +H=C(N 2）2 红色化合物 2、 培养基和试剂培养基：蛋白胨
11、 ,葡萄糖，Cl 5g ，蒸馏水 000m。调节PH 6.5,每管分装 4 5ml ,.06Pa（8lf/i2 ） 0i灭菌 试剂：3、 环节： 1接种与培养 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于 3摄氏度培养4天。 2. 成果观测 在培养 天后，取培养液(约 2l）和等量的 40%AH 相混合，如少量肌酸 （约 0.5mg) ，充足振荡,2 5n 后如培养液呈红色，即为 V.P. 实验阳性，有时须放置更长时间才浮现红色反映。 四、淀粉水解 1、原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进 一步水解为麦芽糖或葡萄糖,淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 2、 培
12、养基及试剂: 培 养 基 : 在 肉 汤 琼 脂 中 添 加 02% 的 可 溶 性淀 粉, 分 装 于 三角 瓶 。01MPa（1lin2）20mn 灭菌备用。 试剂： 3、环节: 将培养基融化后,冷却至 摄氏度左右，倒成平板，凝固后取菌种点钟于平板上(每皿点钟 2 点) ，一般于30 摄氏度培养 24 天,形成菌落后， 在平板上滴加卢哥 尔氏碘液，以铺满菌落为度,平板呈蓝色,而菌落周边如有五色透明圈浮现,阐明淀粉被水解,透明圈的大小,可表白水解能力的大小。 卢哥尔氏碘液 40%NOH（ 或 H) ，肌酸。附表:培养基的配方肉汤琼脂培养基牛肉膏 5克蛋白胨 10克氯化钠 克琼脂 8 克蒸馏水 00 毫升葡萄糖 10 克pH 121灭菌 7.0-7.2淀粉培养基 牛肉膏 5克 蛋白胨 10 克 氯化钠 克可溶性淀粉
