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1、使用细胞工厂与10L 转瓶培养 Vero 细胞和产毒情况比较细胞工厂与10L 转瓶培养 Vero 细胞和产毒情况一、实验目的1、了解熟悉细胞工厂的使用，清洗及再利用的方法 ;2、比较细胞工厂与10L 转瓶同等条件下培养Vero 细胞时各自细胞的生长状态3、比较细胞工厂与10L 转瓶培养 Vero 细胞加毒之后细胞的状态变化和产毒情况;4、通过实验分析用细胞工厂代替原有转瓶生产优缺点;5、通过实验发现细胞工厂中常见问题。二、主要实验工具及材料2 干净的 10L 转瓶一个 （ 表面积约为 2278?）;2NUN公司4层细胞工厂一个（表面积为2520?,编号:140360）,自带一个插拔塞和旋口塞细
2、胞生长液；细胞维持液；毒种（CTN-1V株工作种子批毒种）三、实验过程（ 一 ） 培养Vero 细胞，观察分析及注意事项5 将一瓶已长成致密单层细胞消化，制备成细胞悬液，计数后，按照每 ml 溶液含有1X10个细胞数，及每平方厘米贴壁细胞数相同，根据面积比计算出加入ml数。加入细胞后放置于37?恒温室中培养。6细胞悬液浓度:2.32 X 10个/ml2溶液总体积（ml）加入细胞悬液体积（ml）面积细胞数（个/cm）细胞工厂80034.48 10L 转瓶 1500 31.03观察、分析2010-8-511:00 加入细胞和培养液于细胞工厂和 10L 转瓶中培养13:30观察：细胞工厂中的贴壁细胞
3、数量较10L转瓶多，溶液中含有大量的悬浮细胞 分析 : 细胞工厂是静置培养，细胞贴壁较10L 转瓶快2010-8-69:10 观察细胞工厂 : 细胞状态良好，已伸展，分布均匀10L 瓶 : 细胞状态一般，少许伸展，分布稍有不均分析 :10L 转瓶中的细胞贴壁不均匀，可能是由于细胞总数较少造成（ 二 ） 加入病毒后，Vero 细胞状态的观察分析2010-8-99:30 观察 （加毒前 ）细胞工厂 : 细胞生长成致密单层，间隙很小，排列整齐，分布均匀 10L 转瓶 : 细胞生长成致密单层，间隙很小，排列较整齐，分布稍有不均匀加毒前更换培养液为维持液，再根据比例加入 3.1ml（10L 转瓶 ）3.
4、4ml（ 细胞工厂）病毒2010-8-10 9:00 观察细胞工厂与转瓶中的细胞无明显变化，状态正常，轮廓清晰2010-8-11 9:30 观察细胞工厂与转瓶中的细胞状态正常，无明显病变，无悬浮细胞;10L 转瓶的颜色稍浅2010-8-12 9:00 观察细胞工厂与转瓶中的细胞局问成拉网状，有少量悬浮细胞出现，并且细胞工厂中的悬浮细胞较10L转瓶多，细胞工厂中的PH维持正常，颜色无变化，10L转瓶的PH维持不好，颜色变化明显，PH下降明显。分析：细胞工厂较10L瓶透气性好，所以PH维持得好2010-8-13 9:15 观察细胞工厂与转瓶中的悬浮细胞数量增多，大部分细胞病变明显，成拉网状( 三)
5、 收获病毒液2010-8-16 9:30 收获病毒液前观察细胞工厂与10L 转瓶中有大量的悬浮细胞，考虑收获病毒液。收获病毒液取样: 分别从细胞工厂和 10L 转瓶中取样于青霉素小瓶中，送样检测抗原和感染性滴度四、实验结果分析抗原结果和滴度结果此次实验结果显示，细胞工厂制备的狂犬病毒液，抗的含量和感染性滴度均好于转瓶工艺制备的病毒液。可能与下述原因有一定关系 :(1) 细胞工厂为静止培养法，接种细胞后细胞贴壁良好，分布与较均匀，而转瓶细胞贴壁时间较长，并且稍有不均，因此在一定时间内，细胞工厂细胞长势稍好一些 ; (2)10L 瓶的细胞表面积少于细胞工厂，接种的细胞数是按面积计算，细胞工厂总细胞
6、数多于转瓶培养的细胞数;(3)转瓶工艺加毒时维持液1500ml,细胞工厂维持液是800ml。因此，细胞工厂制备的病毒液的抗原含量和感染性滴度好于转瓶工艺在现有的条件下，很难找到与细胞工厂细胞生长面积和维持液体积一致的对照方法，只能以细胞附着的单位面积，加入细胞数条件控制，但维持液的量则无法控制，只能按常规方法加入。细胞工厂每层液面均分操作:1、将培养基直接倒入细胞工厂;2、将细胞工厂朝有小口的一面放置，平衡一段时间;3、将细胞工厂翻转90 度，带有进液口的一面朝上，静置一段时间，培养基便 会自动平均分配到每一层腔室中 ;4、双手握住进液口的一面，缓慢地将细胞工厂放倒，变成水平放置，不要抓握第一
7、层边缘，以防造成损坏。注意事项 :1、移动细胞工厂的时候要尽量保持水平，否则会造成每层溶液不均匀 ;2、放置细胞工厂的平台或架子一定要水平，防止同层的细胞溶液厚度不同;3、由于细胞工厂的进液口是熔点低的材料制成，因此火焰保护时要小心，不要使之变形 ; 4 、清洗细胞工厂时，如用水流冲洗，切忌用较急的水流冲洗，否则将造成细胞工厂的损坏; 5 、清洗后的细胞工厂放到镜下观察，还可看到少量的细胞残留在上面，不易清洗下来。根据国内其它企业的经验，细胞工厂可重复利用 3-4次，但不能高压消毒灭菌，需要通过钴60 照射之后再利用，增加成本;6、四层细胞工厂放到镜下观察时，只能看到最下一层细胞的状态。10
8、层或 40层中细胞状态的观察则需要用四层细胞瓶对照观察。五、细胞工厂较现在转瓶生产优缺点优点 :1 、节省人力、物力、时间、空间 ;2、方便地按比例扩增;3、受污染风险低;4、瓶间差异变小缺点 :1 、可重复利用的次数较少;2、产品价格较贵;3、消毒需要用钴60 照射 ;4、清洗不方便;5、细胞工厂量较少，按二次收获，仅收获 1600ml,而转瓶可收3000m1;此次细胞工厂滴度较高可许与其收量低有关六、总结细胞工厂做为一个可用于大规模细胞培养的生产装置，具有很多的方便于细胞培养的优点，会给整个生产过程节省人力，时间，空间。但是对于 Vero 细胞的加毒产毒过程还存在许多细胞问题。能否用于疫苗生产，还需要考虑和解决更多的难点。
