纳米技术在产前诊断的应用

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1、采集一一细胞分离、培养一一分析思路：产前诊断(多种方法)：母体外周血中分离胎儿有核红细胞I分离方法(多种)：磁激活细胞分离法(MACS)I纳米磁珠制备、分离原理及步骤 早期产前诊断方法的现状及进展1. 早期羊水穿刺(易失良机，身心损伤，造成流产、畸形增加)(局限性穿刺有最佳的诊断时间、较高的胎儿流产率、导致先天畸形)2. 绒毛活检取样(CVS)(染色体检验结果可假阳性引起肢体缺陷、流产)3. 胚外体腔穿刺4. 植入前遗传学诊断(PGD)(时间限制，步骤复杂)孕妇外周血胎儿细胞的分离及其在产前诊断中的应用目前研究发现在母体血循环中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞如 合体滋养细胞和细胞滋

2、养细胞；另一种是胎儿血细胞，包括胎儿有核红细胞 (NRBC)、淋巴细胞和粒细胞等。一、滋养细胞二、胎儿淋巴细胞三、胎儿粒细胞四、胎儿有核红细胞(NRBC)胎儿NRBC数量较多，约占11周胎儿全部RBC的10%, 19周时的0.5%，此类 细胞含有胎儿基因的全部遗传信息，从6孕周至分娩持续存在于母体外周血中， 而正常未孕妇外周血中几乎无NRBC。同时RBC的生命周期较短，约90天，一 般不会持续到下次妊娠，因此是最理想的分离细胞。细胞分离的方法一、荧光激活细胞分选术(FACS)二、显微操作分离法三、细胞培养四、电泳分离五、磁激活细胞分离法(MACS)(重点)磁性微球(Magnet ic micr

3、ospheres,MMS )通常是由具磁性的内核及核外包裹的高分子外 壳两部分组成。由于磁核对外磁场的响应,MMS可在磁场中定向移动，高分子外壳的表面多 样性决定了MMS可与各种生物活性物质(如抗体、抗原、受体、酶、核酸等)偶联，这些生 物活性物质可在反应介质中进一步识别相应的抗原或抗体、配体、底物、核酸，从而达到分 离或检测目的。1磁性微球的制备磁性微球一般由具有超顺磁性无机纳米磁性材料（Fe、Co、N i及其氧化物等）和高分子 两部分组成。超顺磁性是指当磁性粒子的粒径小于某一临界尺寸（如Fe3O4 30nm）后，在 有外加磁场存在时，表现出较强的磁性；但当外磁场撤消时，无剩磁，不再表现出磁

4、性。 现有技术合成超顺磁性微球的方法主要有包埋法、单体共聚法、化学转化法、共沉淀法和硅 烷化法。1. 1包埋法包埋法是将磁性粒子分散于生物大分子溶液中，采用交联、雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段 通过范德华力、氢键、磁颗粒表面的金属离子与高分子链的螫合作用或共价键，使水溶性高 分子链缠绕在磁性颗粒表面，形成聚合物微球。1. 2单体共聚法单体共聚法采用两种或两种以上单体（其中一种为功能单体）在一定条件下聚合，生成表 面带功能基团的磁性微球，主要包括乳液（无皂乳液）聚合、悬浮聚合、分散聚合和种子聚 合。目前，部分已商品化的磁性高分子微球都是通过将磁流体分散于苯乙烯单体或苯乙烯与 其它功能单体中共聚制得

5、。近年来，通过单体共聚制备磁性微球的方法被广为采用。1. 3化学转化法化学转化法是指将一定浓度的金属离子渗透和交换到大孔树脂中，然后利用化学反应使金 属离子转化为磁性金属氧化物，使之均匀分布在聚合物的孔结构中，渗透和转化步骤可反 复进行。1. 4硅烷化方法当前所采用的硅烷化方法是直接在含羟基的磁性粒子（Fe3O4）表面用带功能基团的硅偶联 剂进行硅烷化处理制备带功能基团的磁性微球，该方法制备过程简单，表面的功能基团含 量高；2磁性微球用于细胞分离的原理和步骤磁性微球分离细胞应用的是亲和作用原理，即将单克隆抗体固定在磁性微球表面形成所谓 免疫磁珠（Immunomagnetic microbead

6、， IMB），它通过表面的单克隆抗体mAb特异地目标 细胞表面的抗原Ag结合，在外磁场的作用下，这些结合7IMMS的细胞可发生定向移动， 从而实现分离的目的。IMMS表面结合抗体的多少，直接决定着IMMS与细胞的结合能力，是 一个关键指标39 ，IMMS只有结合足够多的单抗才能更好地与靶物质结合并减少非特异性 吸附，从而提高分离效果。分离步骤（视频更直观）磁性微球用于分离细胞一般分为细胞标记、磁性分离和洗脱三个基本步骤。其中用磁性微球 标记细胞分为直接标记和间接标记两种方法。直接标记就是用磁性微球直接标记细胞。间接 标记是先用一级配基(一抗)和细胞发生作用,然后用带有二级配基(二抗)的磁性微球

7、和细胞 作用(一级配基和二级配基发生特异性亲和作用)，对细胞实现磁性标记。可能会被问的问题磁性微球分离细胞有两种常用的策略:阳性选择法(Positive selection)和排除法(Depletion)。 阳性选择法是指把目标细胞标记后直接把它们作为阳性的磁性标记组分分选出来。排除法是 指把非目标细胞标记,然后把它们从细胞混合物中除掉。磁性微球分离细胞具有如下优点:(1)可使目标细胞(target cell)直接从原料液如血液、骨髓、 组织匀浆、培养液中分离出来，具有简便、快速的特点;(2)和离心、过滤等方法相比，细胞在磁 性分离时受到的剪切力小，可避免细胞的失活；(3)具有很高的选择性;(

8、4)外加磁场不会对原料 液中的离子和带电溶质的运动产生影响；(5)仪器设备简单，操作费用低。用作细胞分离的磁性微球应满足以下几个标准:(1)大小均一，磁性微球的大小要和细胞大小 相当,一般为15|J m，太小则会被细胞非特异性吞噬;(2)具有尽可能高的比饱和磁化强度和低 的剩余磁化强度;(3)生物相容性好，在料液中不易团聚，具有良好的分散性;(4)具有光滑的表面 和丰富的有机活性功能基团，减少了非特异性吸附;(5)具有较高的机械强度和化学稳定性，内 部磁颗粒包覆严实，不易泄露,避免对细胞造成毒害;(6 )在保存过程中微球表面的亲和配基不 易脱落。(纳米免疫磁珠在细胞分离等方面的应用较普通免疫磁

9、性微球具有明显特点分离过程温和对 细晌无损伤;分离纯度高;清洗阶段无脱落;微球可以滤过除菌;操作过程步骤少;可直接流式细 胞仪检测。制备：一般来说用包埋的方法合成的磁性微球普遍存在粒径较大的弊端,比如用反相乳液法 制备的白蛋白磁性微球粒径在100M m。粒径较大的磁性微球用来分离细胞就会有很多的缺 点:由于其质量太大，在分离过程中对细胞可能造成损伤;用流式细胞进行检测之前必须用酶 先把磁珠切掉，使分离步骤增多。而单体共聚包裹磁性微球存在着包裹太厚、磁响应性太差、 表面基团活化困难，蛋白质吸附率低等缺点。(部分方法的缺点)四大效应(1) 表面效应这是指纳米晶体粒表面原子数与总原子数之比随粒径变小

10、而急剧增大后所引起 的性质上的变化。因为表面原子数目增多，比表面积大，原子配位不足，表面原 子的配位不饱和性导致大量的悬空键和不饱和键，表面能高，因而导致这些表面 原子具有高的活性，极不稳定，很容易与其他原子结合。(2) 小尺寸效应当纳米微粒尺寸与光波波长，传导电子的德布罗意波长及超导态的相干长度、透 射深度等物理特征尺寸相当或更小时，它的周期性边界被破坏，非晶态纳米粒子 的颗粒表面层附近的原子密度减少，从而使其声、光、电、磁，热力学等性能呈 现出新的物理性质的变化称为小尺寸效应。(3) 量子尺寸效应当粒子的尺寸达到纳米量级时，费米能级附近的电子能级由连续态分裂成分立能 级。当能级间距大于热能、磁能、静电能、静磁能、光子能或超导态的凝聚能时， 会出现纳米材料的量子效应，从而使其磁、光、声、热、电、超导电性能变化。（4）宏观量子隧道效应宏观量子隧道效应是基本的量子现象之一，即当微观粒子的总能量小于势垒高度 时，该粒子仍能穿越这一势垒。