太子参杂交育种及后代选育

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1、3太子参杂交育种及杂交后代种胚诱导培养3.1 太子参常规品种间的杂交育种2015-2016年，在柘荣县楮坪乡仙岭村太子参良种产业化技术集成和推广示 范基地内，开展了太子参杂交育种工作，共开展了柘参1号融南种、柘参1号X苏种、柘参1号吹州种、贵州Xffl南种、贵州M工苏种、湖南种 X苏种、湖 南种项州种、江苏种 创南种、江苏种 戏州种等19个太子参组合杂交授粉育 种。收集回13个组合杂交后代种籽，分别采取室内胚芽育苗、大田种子直播育 苗，开展杂交后代的选育。3.1.1 2015年太子参杂交育种组合利用太子参种质资源固各种质观察其形态特征和经济特性，选择优异种质开展太 子参有性杂交，具杂交组合：江

2、苏种 次宁、江苏种 创南种、江苏种 州种、 湖南种 宁种、湖南种 吹州种、湖南种 X苏种、贵州种 宁种、贵州种M工 苏种、贵州种邓中湖南种、寿宁种M工苏种、寿宁种 州种、寿宁种创南种、 柘参1号洲南种、柘参1号X苏种、柘参1号项州种等19个组合。3月1 13 日，进行授粉杂交，5月13-16日收集了江苏种 宁、湖南种 宁种、寿宁 种洲南种、柘参1号 融南种、贵州种W工苏种、湖南种 州种、湖南种M工苏 种、江苏种 创南种、江苏种 戏州种、贵州种W工苏种、贵州种 宁种等11份 组合杂交后代种籽，挑选杂交种籽进行种胚的离体诱导培养，培养株系进行移栽， 进行选育。3.1.2 2016年太子参杂交育种组

3、合在2015年太子参杂交育种的基础上，2016年有针对性开展15个组合的有性杂 交，其杂交组合：柘参1号X苏种、柘参1号项州（三泓）种、柘参1号训 南种、柘参1号出太子参1号、贵州（三泓） ）柘参1号、贵州（三泓）创南 种、贵州（三泓）江苏种、湖南种淅参1号、湖南种项州（三泓）、湖南种X 江苏种、湖南种嫣太子参1号、江苏种淅参1号、江苏种创南种、江苏种X 贵州（三泓）、江苏种 婚太子参1号。3月15-17日进行授粉杂交，5月15日 收集了江苏种出太子参1号、柘参1号出太子参1号、湖南种曲参1号、柘 参1号融南种等4份组合杂交后代种籽，进行冷藏。3.2 太子参二倍体和四倍体之间的杂交育种3.2.

4、1 材料由福建省柘荣县栽培的太子参优良品种 柘参1号”和 柘参3号”进行正反交 杂交。正交：以柘参1号”为母本 柘参3号”为父本进行田间杂交；反交：以柘 参3号”为母本 柘参1号”为父本进行田间杂交。对田间授粉获得的种子进行种 胚的离体诱导培养，并对获得的种胚组培苗进行编号，将 柘参1号”编号为A, 柘参2号”编号为Bo正交获得的种胚组培苗编号为：AB-1 , AB-2，AB-20;反交获得的种胚组培苗编号为：BA-1,BA-2,BA-11。3.2.2 方法3.2.2.1 培养基的制备以MS培养基为基本培养基，添加 3 %蔗糖、0.5 %琼脂、0.2 mg/L NAA激 素，将培养基的pH调为

5、5.8,分装在200 mL玻璃培养瓶中，每瓶培养基的高度 约为1cm,盖紧瓶盖，经高压锅灭菌消毒，设置消毒条件为121C,灭菌16 min, 待灭菌完后取出冷却凝固备用。3.2.2.2 种子消毒选取饱满种子，清水冲洗干净至无杂质再浸泡 5 h,在无菌操作台上，用75% 的乙醇消毒30 s,无菌水冲洗2次;将预处理过的太子参种子先置于 10% NA3PO4 溶液中浸泡10 min,以使种子外种皮软化，增加其通透性；在超净工作台用75% 酒精浸泡30 s,用无菌水洗涤2次，然后用10% NA3PO4浸泡25 min,对其进 行再次消毒，移至灭菌过的瓶子，最后用 0.1%升汞消毒12 min,无菌水

6、荡洗5-6 次，每次2 min,在转移至新的无菌瓶，并用少量无菌水浸泡。3.2.2.3 种胚诱导培养在超净工作台上点燃酒精灯，将剪刀、银子和铁架台依次在酒精灯上灼烧， 消毒5 min后，将剪刀银子放置在铁架台上并将新培养瓶放入超净工作台。用银 子夹取一个无菌盘放于超净工作台上取少量种子于无菌盘上，使用消毒过晾凉的细长尖头镶剥取太子参杂交种胚，先从种子中部开始剥离，用尖头镶切开外种皮 和薄膜内种皮，剥离胚乳层，取出完整的幼胚，将已剥取出的太子参离体种胚接 于诱导培养基中，用标记笔进行标记，放入培养室培养。剥取幼胚时，操作要小 心，避免损伤。各杂交种子分别等量接种于培养基中。 培养环境：温度25土

7、 C, 弱光培养15 d后，转入正常光照培养、光照 2000 lx、光照时间14 h/do 3.2.2.4杂交组培苗扩繁培养对培养成活的杂交种子组培苗株系进行扩繁培养。根据长势健壮的植株生命力比较旺盛的特点，挑选出各个株系健壮的植株。 超净工作台上，将消毒好的剪 刀银子放于铁架台上冷却备用，打开母瓶和新配制的培养基培养瓶瓶盖，剪下组培苗的茎段，修剪至带腋芽茎段1 cm,将茎段的形态学下端接入培养基中，保 证茎段可以吸收到培养基的养分。经火焰消毒瓶口及瓶盖后盖上盖子，进行标记， 接种后用上述的培养条件进行培养。每瓶接 5-6个带芽点的茎段，每个株系约扩 接4-5瓶，保证每个株系能增殖形成 20-

8、25株左右的健壮组培苗。3.2.2.5 杂交种子组培苗的气孔观察先观察柘参1号”和柘参3号”组培苗气孔特征，作为典型的太子参二倍体 组培苗和四倍体组培苗的气孔特征,然后观察各杂交种子株系组培苗的气孔特征, 与前面典型的太子参二倍体和四倍体组培苗的气孔特征进行比较。选取培养45天以上的太子参组培苗，于每天下午 2点-3点，在超净工作台 上，剪取太子参组培苗成熟叶片于无菌盘中，置于 0.35 mol/L NaCl溶液中防止 叶片干瘪，做好各株系标记。选取同株系不同株的成熟叶片3-4片，用刀片在叶片的下表面划一刀，从刀痕口撕取靠叶片中部的下表皮，铺平于含有0.35 mol/LNaCl溶液的载玻片上，

9、盖上盖玻片，用吸水纸沿盖玻片将水吸干。通过显微镜 随机观察同株系的叶片下表皮，每片叶片观察4-5个气孔，仔细观察气孔的特征、 测量保卫细胞的长度、统计保卫细胞内叶绿体的数量，做好相应的数据记录。3.2.2.6 杂交种子组培苗的染色体的倍性鉴定选取太子参的茎尖作为染色体倍性鉴定的材料。于早上8点-11点，在超净工作台上，对培养的杂交种子各株系的组培苗茎尖进行剪裁，将每个株系的茎尖剪成约0.5 cm大小，每个株系放在一个无菌盘中，从超净工作台取出后，装入 1.5 mL离心管中，做好相应的株系标记，置于放入 4c冰箱中预处理24 h,然后 用Carnoy固定液对材料进行固定24 h,剥取微小茎尖，进

10、行染色、压片和观察。 3.2.3结果与分析3.2.3.1 杂交种子组培苗各株系培养通过对柘参1号” 参3号”杂交获得的种子进行组织培养，剥取种胚诱导培 养打破种子的休眠特性，胚芽先长出丛生芽，胚根再渐渐长出，经过 30天的培 养，对各株系进行扩繁培养，使各种子都有一定数量的组培苗， 保证有足够的材 料可以进行成熟叶片下表皮气孔的观察和染色体观察。3.2.3.2 杂交种子组培苗的染色体倍性鉴定3.2.3.2.1 太子参各株系组培苗气孔的观察如图3-1通过对 柘参1号”、柘参3号”及22个杂交株系组培苗的气孔大小 及其保卫细胞叶绿体数量的认真观察比较，AB-10和AB-18株系组培苗的保卫细胞长度

11、较短，平均约41仙四气孔呈圆形，叶绿体平均有16个，与柘参1号” 的气孔特征相近。有19个杂交株系的保卫细胞长度较短较长，平均约 56N叫 气孔呈长椭圆形，叶绿体平均约 32个，与柘参3号”的气孔特征相近。但这22 个杂交株系染色体倍性的准确确定，还需要经过染色体压片技术对其倍性进行准 确的鉴定。(a) (b) (c)柘参1号”气孔特征柘参3号”气孔特征气孔特征 气孔特征(c): AB-14气孔特征(f): BA-10气孔特征(a)：(d):(b) : AB-10 (e): AB-23.2.3.2.2 太子参各株系染色体观察植株的茎尖和根尖都存在分生组织，具有旺盛的分裂能力，一般取植株的茎 尖

12、和根尖进行染色体的倍性鉴定。太子参组培苗的根尖十分细小，细胞也较小， 存在的分生组织较少，不容易观察到染色体；而通过在解尸镜中剥离出茎尖的顶 端生长点，虽然操作比根尖处理麻烦，但能够找到较多细胞分裂中期的染色体。 因此，选取太子参的茎尖作为染色体倍性鉴定的材料。(a) (b) (c)(d) (e) (f)(g) (h) (i)(j) (k) (l)图3-2太子参部分株系组培苗的细胞染色体（a）:柘参1号”的染色体（b） :AB-10的染色体（c）: AB-18的染色体 （d）: AB-14的染色体（e）: AB-14的染色体（f）:柘参3号”的染色体 （g）: AB-3的染色体（h）: AB-

13、5的染色体（i） : AB-12的染色体 （j）: BA-2的染色体（k）: BA-11的染色体（l） :BA-6的染色体在显微镜下大面积搜寻处于细胞分裂中期的染色体， 可以更加准确地观察染 色体的数目以及判断染色体的倍性。 如图3-2染色体的形状在压片的过程中呈现 各种各样，有粗短的小短杆，有两个小长条连接的带状，有明显的姐妹染色单体 性状组成，有两个浓缩的姐妹染色单体组成等。图 3-2 （d）、（e）的细胞染色体 较分散，染色体平均约有48条，初步鉴定为三倍体；图3-2 （b）、（c）的细胞染 色体均为32条左右为二倍体。如图3-2 （g） - （l）为19个太子参的部分株系的 细胞染色体

14、，具均为64条左右为四倍体。因此，在此次培育的杂交组培苗中共 收获2个二倍体株系，1个三倍体株系，19个四倍体株系3.2.4 太子参杂交种子种苗细胞学观察统计分析实验共培养成活31个种子组培苗，其中有少部分株系培养过程染菌或组培 苗较少、生长较慢，未继续观察鉴定。有若干个太子参种胚没培养成活，此次鉴 定共鉴定了 24个株系（包括 柘参1号”和 柘参3号”）。表3-1太子参各株系组培苗气孔及染色体特征统计表I编R度（im）平均数量（个）（个）染色体倍数A4414322倍体B5229644倍体AB-15329644倍体AB-25732644倍体AB-35531644倍体AB-55027644倍体A

15、B-66032644倍体AB-104120322倍体AB-125732644倍体AB-145428483倍体AB-165631644倍体AB-175128644倍体AB-183912322倍体AB-196233644倍体AB-205932644倍体注：未列出的株系是由于培养过程染菌死亡或组培苗偏小偏少未鉴定表3-2以太子参各株系组培苗气孔及染色体特征统计表n株系保卫细胞平均长保卫细胞叶绿体数染色体数量染色体倍数编P度（im）平均量（个）（个）A4414322倍体B5229644倍体BA-15127644倍体BA-25428644倍体BA-35529644倍体BA-55629644倍体BA-65830644倍体BA-75629644倍体BA-85729644倍体BA-105930644倍体BA-