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1、贴壁细胞的免疫荧光染色方法Materials:1. PBS solution2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative):Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mlPBSsolution,stir at 70 todissolve;3.PBS-Tsolution:(0.1% Triton X-100 in PBS solution)4.PBS-Bblockingsolution:(4%BSA inPBSsolution)5.Primaryantibody:DilutewithPBS-Bsolution, dilutionfactor
2、s shouldrefer to manual, or, test from 1:50200, shouldbe moreconcentrate thanapplicationin Western blot;6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual Procedure:1.Culturedcells,letit attachtothecoverslipsin6-well plate;2.Removemedium,rinse withPBStwice;3.A
3、dd 2ml4%paraformaldehyde,incubateatroom temperaturefor20minutes;4.Rinse with 2ml PBS three times,rinse for5minuteseverytime;5.Permeabilizecellswith 2mlPBS-Tsolutionat4?C for 10 minutes;6.RemovePBS-Tsolution,rinsecells withPBSfor 5minutesatroomtemperature;7.Block non-specificinteractionwithPBS-B solu
4、tion at37?Cfor30minutes;8.Add primary antibody solution, incubate at4?Covernight;9.Removeprimaryantibodysolution,wash with PBS for 5 minutes;10.Add secondaryantibodysolution,incubateatroomtemperaturefor1 hour;11. Wash with PBS three times, 5 minutes each;12. Add anti-fade DAPI solution if needed;13.
5、 Observation.细胞免疫荧光步骤1.细胞爬片；2.4% 多聚甲醛固定10min( 固定细胞器用预冷的70% 甲醇 +30% 丙酮) ；3.PBS 漂洗 5min ；Triton穿孔15min( 丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS 漂洗2 次，每次5min ；6.1%BSA 封闭30min ；7.加入 1%BSA稀释的一抗，于37 杂交2h；8.PBS漂洗2 次，每次5min ；9.加入 1%BSA稀释的二抗，于37 杂交1h；10.PBS 漂洗 2 次，每次 5min ；11.5ug/mlDAPI 染色 2min ；12. 抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂 :2.5% DABCO (
6、w/v) 50mM Tris(pH8.0)90%甘油作为荧光显微镜使用：（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15 分钟。（ 2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。（ 3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。（ 4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。作为荧光显微镜使用：（1）先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15 分钟。（ 2）等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。（ 3）关闭显微镜光源，打开荧光通道。（ 4）需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按
7、扭。细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定 10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇 +30%丙酮 )PBS 漂洗 5min0.5% Triton 穿孔 15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS 漂洗 2 次，每次 5min1%BSA 封闭 30min加入 1%BSA 稀释的一抗，于37杂交 2hPBS 漂洗 2 次，每次 5min加入 1%BSA 稀释的二抗，于37杂交 1hPBS 漂洗 2 次，每次 5min5ug/ml DAPI 染色 2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml 甘油0.5ml
8、 1M Tris(Ph8.0)70溶解， -20保存0.5ml ddH2O2005-07-2520:25免疫荧光第一步的步骤几注意事项1.首先是玻片的处理: 泡酸去污, 冲洗,晾干 ,泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗( 此时要用镊子夹着洗),晾干备用.2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞 , 还是贴壁不大好的细胞比如神经元前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片 ,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片3. 固定 ,我用的是预冷纯丙酮固定15 分钟 (应为丙酮有毒 ,操作的时候小心些 ), 这步应该注意 : 丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这
9、一步不要在6 孔板内进行 ,因为丙酮会将其熔化 .4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达如果在胞浆表达,可以不用0.01% 的 TRITON X-100 渗透 (我前几次用了TRITON, 结果胞核也表现出很强的荧光 ),当然 , 如果一抗是在胞核内表达要用TRITON渗透 15分钟5. 5% 的正常山羊血清或是5% 的 BSA 封闭 ,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液 .6. 加一抗 ,根据你所做抗体的需求稀释, 一般是先将稀释液加到EP 管里 ,后加一抗 .( 一抗在吸出来之前要离心 10-20 秒 ), 一抗的量要多加些 ,也是为了避免干片 .7. 孵育抗体 : 最好是4
10、度冰箱过夜 ,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16 个小时 ,此时要 将 6孔板做成湿盒 ,目的是妨干片 .在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失 .注意 ,PBS 液的 PH 值要调在7.4 左右孵育一抗不能干片,孵育一抗时间要久;其四 ,多余的封闭液不能洗掉,只能甩干2005-07-2520:51总之 , 首先 ,应该注意的是片子有没进行了脱脂处理;其二 ,注意洗片用PBS 的 PH 植要在 7.4 左右 ;其三 , 固定 ,孵育一抗不能干片 ,孵育一抗时间要久 ;其四 ,多余的封闭液不能洗掉 ,只能甩干 ;其五 , 要注意避光说了这么多 ,嘿嘿 , 最重要的一点是 : 你以后阐述问题
11、的时候请具体一点 , 不要让回答问题的人遍地撒网 , 好累呀 !2009-01-2310:50首先用 16 孔板没有任何问题分析没有荧光的结果1. 固定最好用 4% 多聚甲醛 30min2.一抗 孵育时间太短我的经验37 度2小时或者 4度过夜效果更好3.二抗孵育时间是多少？建议37 度 2-3小时 我也有做过 5个小时的最后 你用的是那种 ccd 的荧光显微镜吗？有的时候染的不好镜下看不到荧光但是是可以照出来的！Fix cells in 2% formaldehyde in PBS/pH 7.4 for 15 min. at 20oC. 2% formaldehyde is made up
12、fresh prior to use by dissolving the appropriate amount of EM grade paraformaldehyde (Prill form, from Electron Microscopy Sciences) in PBS and heating on a hot plate in the hood (setting of 5-6) until the aldehyde goes into solution. Keep the bottle cap loosened so that pressure does not build up. Cool down to 20oC and pH to 7
