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1、自生固氮菌的分离鉴定杨从发1,王淑军1,陈静1,许兴友2(1.淮海工学院食品工程系，江苏连云港，222005)(2.淮海工学院化学工程系，江苏连云港，222005)淮海工学院学报，1999，8(2)摘要：从非豆科作物根际土壤中分离筛选得到213个在无氮培养基上能良好生长的菌株，通过酶活测定， 从中筛选得到18株固氮能力较强的菌株，并对其中酶活最高的4株菌株进行了鉴定，结果表明它们属于 固氮菌科的不同属。利用它们可望制成适合于不同农作物生长的生物复合肥。关键词：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料0引言微生物肥料的一些作用和生态效益是化学肥料所不具备的1，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺 激作物生长
2、和抑制有害微生物的活动，从而达到增产的目的。此外，生产微生物肥料投资少，可利用农 副产品就地取材。因而，微生物肥料的生产吸引了许多研究者的兴趣。本文报道从水稻、小麦、玉米和蔬 菜等非豆科作物根际土壤中分离得到18株固氮能力较高的自生固氮菌，并对其中am65、bn72、cx58t、dy82 四株固氮能力最高的菌株进行了分类鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。1材料和方法1.1菌种采集水稻、小麦、玉米和蔬菜等农作物的根际土壤土样56个，从中分离获得213株在无氮培养基上 能良好生长的菌株。1.2分离培养基及分离方法1.2.1富集培养基蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2
3、g，碳酸钙1g，质量分数为10%的钼酸钠、硼酸、 硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各1mL，水1000mL，pH为6.57.0，在250mL三角瓶中，每瓶分装30mL， 灭菌备用。1.2.2富集培养方法取35g 土样用50mL水制成混浊液，吸取5mL悬浮液装入盛有30mL富集培养液的250mL三角瓶 中，100rpm，28，培养35天后，换新鲜培养基继续培养，重复45次后，稀释分离。1.2.3平板分离培养基在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。1.2.4分离方法取富集培养后的培养液，稀释涂布平板分离培养基28C培养2天后，将在稀释度较大的平板上，生 长较大的
4、菌落移入斜面。培养后，保藏备用。1.3固氮酶活性测定1.3.1气相色谱法参考文献3的方法，略加改变，将2mL乙炔气体冲入试管斜面内，塞上无菌橡皮塞，28C，培养24h 后，用气相色谱仪测量固氮酶的活性，每种取45个重复，进样量100 ML，按以下公式进行计算酶活。EA7=(58.0 XSeXTX Pe)/(Sb XTeXPX t)(以mol/h(斜面)Se：乙烯峰面积;T：开氏绝对温度(T=273.13K)Pe :实验条件下的大气压强(Pa);Sb：乙炔峰面积;Te：实验条件下的温度(K);P：绝对大气压强(P=101324.72Pa);t=培养时间(t=24h)1.3.2微量凯氏定氮法囹用以
5、下公式计算含氮量:EA2=(V1-V2) X14X 1000)/V(mg/L)V1：样品滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数；V2：空白滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数；14：是1个毫克当量氮的毫克数；V：发酵液样品毫升数。2结果和讨论2.1分离结果从非豆科作物根际土壤中分离得到213个菌株，用气相色谱法和微量凯氏定氮法测定它们的固氮酶活 性。结果发现，34株没有固氮能力(含氮量1mg/L), 161株有固氮能力(含氮量110mg/mL), 18株固氮 能力较强(含氮量10mg/mL),其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌产酶能力最高。表1对固氮能力较强 的18株菌株的
6、酶活测定结果进行了统计。表1：固氮酶活力测定结果(18株菌株)HQ E A2 荣株母r.ti 心pm a l-h |/i.11. .1Ml1 .1. D14. Ah?i7；板n46. 1Hl*1 LIn. 4.H. n笠.im1 1 2. 2/i. pm cil/h |Zim 155. 5任.61 21 . 27Ti斗 r.14. n30. 51 DI . 2牌.H771647. .1.12. 7p心扑.4.ID. 6表1中,，EAl(“mol/h斜面)是用气相色谱法) EA1=(58.0XSsXTxPe)/(SbXiTeXPXt)U 底U定各菌株的试管斜面的固氮酶活性值。按以下公式计算: r
7、H4ri 45. 4 Iri. 2虽然理论上，在固定条件下，乙快还原活性与固氮酶对氮气的固定活性呈正相关，但在实际实验过程中，会由于斜面的新鲜程度，斜面培养基中的杲些组成等原因，而影响实验结果的准确性，所以，每种菌都取5支对数生长期的斜面做重复试验，以尽量减少误差。EA2(mg/L)是将菌株接种到无氮培养液中，28C，100rpm培养7天后，用微量凯氏定氮法测定最终发酵液的含氮量。按以下公式计算：EA2=(V1-V2)X 14 X 1000)/V(mg/L)经回归分析6，EA1与EA2呈强正直线相关(相关系数r=0.9527)，回归方程为 EA2=7.9560+0.5016XEA1，其结果与文
8、献3的有关报道相似。2.2鉴定结果2.2.1形态特征见表2所示。表2 形态特征垠.咨大小/hepH生K泡阳程度扒国也”:.氏染皂岸采现穿刺3力就力拶饱推当辎毛英景帽落有堵肄基凿落眷养堆.脂am 6Sh?i72dyS3设逮廉铸状杆曹轩琳杆菌3. 0 3. 5” 2e 5* 3t 0m 1. 52 2. 5- 35, 5- 9. 0果适丘.$ 7-rS- 4QU摧淹黑 meSH阻叫mn+抻.状云状馆状i好初+无有度白挡粘利 边缘瞥齐光 滑中间凸起1如邛挡沾缘 书瞥汗布皱 折中闻凹陷跳白挡湿树 光滑耕剖乍 松5折点平乍&牛.t R好乍L R妤揭岂湍平即白生耕剖汨白色拈醐玳芯白皂拈利同心即湿润生怆好想
9、光消洲润润光描中同精摒润生L粘幸i乍柱好凸起生怆好5H白生湿润 光尚软卜沾 缘茫许牛.怡 度好白批黄 光气幅白能鄙润沾白也后平就润光:消度沾缘不涟丹落较小乍柱R妤落较大生L51 嫌有皱折 生L R好2.2.2生理生化特征见表3所示。表3生理生化特征试11城株号HE 6Shn73q弥dy!t2用域耕还原道臆+汶策化氨酵羽臆+淀翰分解:臆+ ?+II询那舜露求+ ?+机氛代替扪甘+表4褐球固氮菌、拜氏固氮菌和敏捷单抱菌模式种的特征特E-州1井比闾霞族1墩登M早电UK白II术解叫挡常图谁粉水藉+甘膈+周乍同牛.彬成例囊+网乍英眯粘被+通常的生存部的十一堵七我被求RNA的悝基比回，65* 6655*
10、$42.2.3命名根据以上形态和生理生化特征，参照伯杰细菌鉴定手册（表4、表5列出了其中有关模式种的鉴别特 征），将以上四株菌命名如下：am65：与固氮菌科，氮单胞菌属的敏捷单胞菌相近，但甘露醇发酵及淀粉分解试验与模式种不同，暂 定名为氮单胞菌 am65(Azom onas sp.am65)。bn72：与固氮菌科，固氮菌属的褐球固氮菌相同，定名为褐球固氮菌bn72(Azotobacter chroococ- cum bn72)。cx58：为固氮菌科，拜叶林氏菌属。兼有弗来明拜叶林氏菌和运动拜叶林氏菌的部分特征，其种的特 征还有待于进一步鉴定，暂定名为拜叶林氏菌cx58(Beijerinck i
11、a sp.cx58)。dy82：与固氮菌科，固氮菌属，拜氏固氮菌相同，定名为拜氏固氮菌dy82(Azotobacter beijerinckii dy82)。表5拜叶林氏菌属内运动拜叶林氏菌和弗来明拜叶林氏菌的特征特 E种特 E前种濯助并列林氏菌布末明年1林氏布末明耳1林氏求常汽株生世光生最室龄臼0勺縻藩麒色茹汨咬挡黄福也浅榆切色如的助对+ + +二炒 L - 1酪白洋菜1.的牛io(r15+ +-zw大门老景为康和割御的胡&-州乳啡a203000u础403D0注：+：少数细胞，绝大多数在幼龄时期；*:数字是代表在培养基上生长的菌株的百分数;+(-)：大约所测定菌株的40%50%为阳性；+：生长好；-/W：反应阴性或弱。参考文献：1 陈廷伟，葛诚.我国微生物肥料发展趋向J. 土壤肥料,1995,(6):1620.2 李元芳.有效活菌数的测定方法允许差与判定J. 土壤肥料,1997,(4) :4344.3 程萍.固氮菌肥料生产菌株的酶活性测定J. 土壤肥料,1995, (1) :4446.4 无锡轻工业学院等合编.食品分析M.北京:轻工业出版社,1991.216219.5 布坎南RE,吉本斯NE等.伯杰细菌鉴定手册M.第八版.北京:科学出版社,1984.12.6 潘维栋.数据统计方法M.上海:教育出版社,1984.8.
