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1、微生物的计数血球计数板法【摘要】测定微生物细胞数量的措施诸多，有分光光度法、显微直接计数法和平板计数法。分光光度法比较简便,易操作,但是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小。 显微计数法合用于多种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易辨别。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（PtrHaser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相似，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观测。而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。本实验采用血球计数板法，重要目的是理解血球计数板法的构造和使用措施,学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。
2、 一、实验目的与规定 1、理解微生物计数常用的三种措施:分光光度法;平板计数法;血球计数板法。 、理解血球计数板的构造和使用措施。3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。二、基本原理运用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的微生物计数措施。此法的长处是直观、迅速。将通过合适稀释的菌悬液（或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），因此可以根据在显微镜下观测到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和,故又称为总菌计数法。血球计数板,一般是一块特制的载玻片,其上由四条槽构成三个平
3、台。中间的平台又被一短横槽隔成两半,每一边的平台上各刻有一种方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室,微生物的计数就在计数室中进行。 计数室的刻度一般有两种规格,一种是一种大方格提成16个中方格，而每个中方格又提成2个小方格；另一种是一种大方格提成5个中方格,而每个中方格又提成个小方格。但无论是哪种规格的计数板,每一种大方格中的小方格数都是相似的,即625=400小方格。 每一种大方格边长为1m,则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.m，因此计数室的容积为01m3。 在计数时,一般数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上6或2
4、,就得出一种大方格中的总菌数，然后再换算成1m菌液中的总菌数。 下面以一种大方格有2个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为，菌液稀释倍数为B，那么，一种大方格中的总菌数 因1l1m=1000m， =5000AB(个) 同理,如果是16个中方格的计数板,设五个中方格的总菌数为A，则 三、实验材料）菌种:酿酒酵母菌2)用品:显微镜、血球计数板、酒精灯、盖玻片、接种环、番红染液、胶头滴管。 四、实验措施 1、实验流程图 制备稀释液加样找计数室计数 2、实验环节1)镜检计数室:在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才干进行计数。 2)将酿酒酵母菌悬液进行合适稀释，菌液
5、如不浓,可不必稀释。 3)取干净的血球计数板一块,在计数区上盖上一块盖玻片。然后在显微镜下找到计数室。若计数室沾有杂质或者菌体,要用蒸馏水冲洗计数板,用滤纸吸干其上的水分。然后再放到显微镜下找到计数室。 4）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少量,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边沿摘入一小滴(不适宜过多)，让菌悬液运用液体的表面张力布满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。5)静置半晌，先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观测并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观测时应削弱光照的强度。)计数时若计数区是由16个大方格构成,按对角线方位，数左上、左下、右上、
6、右下的4个大方格(即小格）的菌数。如果是2个大方格构成的计数区,除数上述四个大方格外,还需数中央l个大方格的菌数(即8个小格)。如菌体位于大方格的双线上,计数时则数上线不数下线，数左线不数右线,以减少误差。本实验采用25格16格的血球计数板。计数时应数个大方格。 ）计数。每个样品反复计数23次(每次数值不应相差过大,否则应重新操作)，求出每一种小格中细胞平均数(N),按公式计算出每m（g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。8）测数完毕，取下盖玻片,用水将血球计数板冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。 ）计算成果。 可用如下公式进行计算（1）16
7、格格的血球计数板计算公式:细胞数/m10小格内细胞个数10040000稀释倍数（2)2格1格的血球计数板计算公式：细胞数/m0小格内细胞个数/8041000稀释倍数五、 实验成果计算次数各大格中细胞数大格中细胞总数稀释倍数总菌数（CF/或g）左上右上左下右下中间第一次3237409449010六、结论与分析1、误差来源本次实验中我们组用的是2号酵母培养液，是本次实验所用的酵母培养液中浓度最高的培养液。但是通过教师分析,实验数据仍然偏大的一点。产生这种误差的因素大概如下：酵母细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员不注意细节,器材解决、使用不当，稀释不精确,细胞辨认错误等因素
8、所导致的误差属技术误差;而由于仪器(计数板、盖片、吸管等)不够精确与精密带来的误差称仪器误差,由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差(fieero)。 由于时间的关系，实验计数的次数太少,难以得到精确均匀的实验数据。在实验过程中，操作人员也存在一定的不严谨性,导致实验成果产生误差。由于没有足够多的平行数据，难以用科学的计数措施进行成果的计算,因此难以得到比较精确的实验数据。 因此,搞好酵母细胞计数的质量控制一般需采用如下措施。1)避免技术误差，纠正仪器误差所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合规定或通过校正。严格操作,从消毒、稀释、加样
9、到计数都应规范，特别应注意的是样品稀释要作到充足混匀。必须一次性布满计数室，避免产气愤泡,充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边沿为宜。2)缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或，而我们所能计数的细胞分布范畴是有限的，由此导致的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效措施就是尽量扩大细胞计数范畴和计数数目,一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范畴，只要能将误差控制在容许范畴内即可。2、局限性之处 血球计数板在显微镜下直接进行测定。它观测在一定的容积中的微生物的个体数目,然后推算出含菌数,简便快捷。但是在计数时涉及死活细胞均被计算在内
10、,尚有微小杂物也被计算在内。这样得出成果往往偏高，因此合用于对形态个体较大的菌体或孢子进行计数。七、 思考题1、试述血球计数板的计数原理。为什么用两种规格不同的计数板计数同同样品，成果是同样的? 答:每块计数板由形凹槽分为2个同样的计数池计数池两侧各有一支持柱,将特制的专用盖玻片覆盖其上,形成高010m的计数池。计数池画有长、宽各.mm的方格,分为9个大方格，每个大格面积为1.mm；容积为0.1mm,中央大方格用双线提成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域,用单线划分为个小方格。四角的4个大方格是白细胞计数区域，用单线划分为1个中方格。血球计数板的计数原理:通过对一定数量的小格计数,根据相应小格所占的体积，可以推算出单位体积的溶液中微生物细胞的密度和总数。由于不同规格用不同的计算公式计算，最后得出的都是微生物细胞的密度和总数，因此成果同样。
