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1、河南科技学院新科学院2014 届本科毕业论文论文题目 超高压对胃蛋白酶酶解特性的影响学生姓名：袁秋霞所在院系：食品科学与工程系 所学专业：食品科学与工程导师姓名：马汉军 完成时间：2014年04月20日摘 要采用不同压力及保压时间处理酪蛋白进行酶解反应，首先以水解度、氮存在形式及含量为测定指标，研究了高压处理对胃蛋白酶酶解酪蛋白的影响程度；之后通过测定巯基、疏水键特征性指标，研究了高压处理对胃蛋白酶酶解特性的影响。结果表明100MPa、15min时，水解度最好为11.1%，比未处理样水解度8.27%提高了34.22%；100MPa、15min时可溶性氮、肽基氮含量最低，氨基氮含量最高，可溶性氮
2、转化了部分氨基氮；酶解产物巯基含量、疏水性指标均在100MPa，15min时最低，为2.5978mol/g、1306.8So，说明高压改变了蛋白质的三、四级结构。关键词: 酪蛋白；超高压；酶解产物；酶解 Effects of Ultra-high Pressure on the Characteristics of Pepsin Digestion AbstractDifferent pressures and dwell time to deal with casein enzymatic hydrolysis reaction，first, the degree of hydrolysis
3、，the presence of nitrogen in the form and content of measurement indicators, which studied the influence of high pressure treatment pepsin digestion of casein;then by measuring the thiol group and hydrophobic bond characteristics index,which researched the effects of high pressure treatment on the c
4、haracteristics of pepsin digestion.The results show the best degree of hydrolysis that the data of 100MPa, 15min are 11.1%,which improved 34.22% compared to the untreated sample the degree of hydrolysis 8.27%; It is the lowest which the content of soluble nitrogen and peptide-based nitrogen at 100MP
5、a, 15min and the highest content of amino nitrogen, then soluble nitrogen into some amino nitrogen; it is the lowest which Hydrolysates sulfhydryl content and hydrophobicity index is 2.5978 mol/g, 1306.8So at 100MPa, 15min,which illustrated that high pressure changed three or four structural protein
6、s.Key words:Casein; Ultrahigh pressure; enzymatic hydrolysate; Enzymatic 目录引言11试验材料与方法11.1 试验材料11.2 仪器设备21.3 实验方法21.3.1 胃蛋白酶解液：21.3.2 超高压处理21.3.3 酶解反应21.4 指标的测定21.4.1 酶解液水解度的测定21.4.2 氨基氮、可溶性氮和肽基氮含量分析31.4.3 巯基(SH)含量分析31.4.4 疏水性测定32结果与分析42.1 不同压力及保压时间对酶解液水解度的影响42.1.1 压力大小对酶解液水解度的影响42.1.2 保压时间长短对酶解液水解度
7、的影响42.2 不同压力及保压时间对氮存在形式及含量的影响。52.2.1 不同压力对氮存在形式及含量的影响52.2.2 保压时间对氮存在形式及含量的影响52.3 不同压力及保压时间对巯基含量的影响62.3.1 不同压力对巯基含量的影响62.3.2 保压时间对巯基含量的影响62.4 不同压力及保压时间对疏水性指标的影响72.4.1 不同压力对疏水性指标的影响72.4.2 保压时间对疏水性指标的影响7结论9参考文献11致谢13引言酪蛋白具高的营养价值，是一种全蛋白，在牛奶中的含量能达到80%，常作为婴幼儿的代乳品1。但酪蛋白在胃中形成的凝块较大，易导致婴儿的消化不良，此外，-乳球蛋白易引起婴儿的过
8、敏反应等2。采用蛋白酶对牛乳蛋白进行适度酶解可以提高蛋白质的利用率及生物价，避免了婴幼儿的不良反应。酪蛋白经过酶解后，乳化性、凝胶性、热温度性均有提高3。此外，酪蛋白酶解过程中，产生多种具有生理功能的活性肽4。 超高压技术是近二十几年来兴起的一项新技术，有以下显著特点：首先，在保持制品营养成分和风味的前提下，延长制品的贮藏期、提高安全性、改善组织结构、调节酶活力等，是目前食品科学领域研究的一个热点5-7；其次，超高压技术灭菌均匀，操作安全，且能耗少，无“三废”污染。超高压处理下，蛋白质三、四级结构中的氢键、离子键和疏水键等非共价键被打开，使之变成无秩序的肽链状态，而使得分子结构伸展而变得松散8
9、。酶是一种特殊的蛋白质，超高压处理能影响其结构和性质，从而影响酶对蛋白质的催化特性。经研究发现：酶活性中心的基础是蛋白质的三级结构，较低压力可使常压下完整组织中经常被隔离的酶和基质相接触，加速酶解反应的进行，从而暴露出更多结合位点，易于酶解反应的进行9。低的压力也可以通过解离蛋白，松散其蛋白结构，从而暴露出更多结合位点，使一些在常压下受抑制的酶激活。Cheftel10在研究高压对蛋白质的影响时发现：压力不仅可通过解链、离解或蛋白质水解提高肉的嫩度，且可通过解链增加蛋白质食品对蛋白酶的敏感度，提高可消化性和降低过敏性。本课题组前期的研究也发现：高压处理不仅可使肉类嫩化效果得到较大的改善11-15
10、，还可显著提高胰蛋白酶对肉类蛋白质的消化能力16，表明该处理手段不仅可用于肉类蛋白的结构与功能特性改善，还可用于提高肉类蛋白的酶解敏感性。本实验的目的是通过单因素法确定不同的压力、保压时间作用，酪蛋白变性特性，以水解度为特征性指标，研究该蛋白在胃蛋白酶作用下，以高压处理的胃蛋白酶水解酪蛋白，测定其酶解产物的水解度、不同氮形式（可溶性氮、氨基氮、肽基氮）及含量，并通过对酶解产物中巯基含量、疏水性的分析，研究了高压处理对胃蛋白酶酶解特性的影响，以期为进一步探索超高压促进胃蛋白酶酶解的机理打下基础。1试验材料与方法 1.1 试验材料 胃蛋白酶：上海晶纯生化科技股份有限公司，酶活力1:15000；酪蛋
11、白：北京索莱宝科技有限公司。主要试剂：甲醛，盐酸，三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），乙二胺四乙酸（EDTA）二钠，甘氨酸，尿素，5,5-二硫双-2-硝基苯甲酸，三氯乙酸，磷酸盐，1-苯胺基-8-萘磺酸等。实验中所用其他化学试剂均为分析纯。 1.2 仪器设备 超高压处理装置（包头科发公司）；多功能真空包装机：山东省诸城市中鼎机械；SHA-C数显水浴恒温振荡器：江苏省金坛市华峰仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；KjeltecTM8400全自动凯氏定氮仪，FOSS Denmark；TU-1810型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；MULTIFUGE XIR型冷冻离心
12、机 Thermo German；ALPHA1-2LD型冷冻干燥机，Christ German；凝胶色谱仪。 1.3 实验方法 1.3.1 胃蛋白酶解液： 在测定前，胃蛋白酶溶于pH1.5的盐酸溶液，使浓度达到2mg/ml，4冷藏，等待高压处理或作为对照样。 1.3.2 超高压处理 酶溶液用聚乙烯塑料袋真空密封包装(50mL/袋)，置于4的冰箱中保存(待用)。用不同压力(50、100、150、200MPa)及不同保压时间(5、10、15、20min)处理酶溶液，对照样：未经高压处理的酶液。 1.3.3 酶解反应 将一定量的酪蛋白在磁力搅拌器上边搅拌边加入到处理过的酶溶液及对照液中，制成底物浓度为
13、10mg/ml的悬浮液，置于水浴恒温振荡器中55酶解6h(反应体系的pH、酶浓度、底物浓度、酶解温度和酶解时间已经过优化)。酶解结束后沸水浴灭酶10 min使酶失活，冷却至室温后，4冷藏，测定其不同指标。 1.4 指标的测定 1.4.1 酶解液水解度的测定 甲醛滴定法测酶解液水解度的测定17,18，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混匀后取20mL置于200mL烧杯中，加入60mL去CO2水，用0.05 mol/L标准NaOH溶液滴定至pH8.2。加入10mL甲醛溶液，混匀后再用0.05 mol/L标准NaOH溶液继续滴定至pH9.2，同时用蒸馏水代替酶解液做空白对照。记录所消耗
14、的标准NaOH溶液的体积，计算水解度（DH）。 (1) 试样中氨基酸态氮含量（X）按下式进行计算： 式中：X试样中氨基酸态氮含量，单位为克每百毫升（g /100mL）；V1测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单 位为毫升（mL）；V2试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）； V3试剂稀释液取用量，单位为毫升（mL）； c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； 0.014与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（g）。 1.4.2 氨基氮、可溶性氮和肽基氮含量分析 氨基氮含量测定：采用甲醛滴定法19。 可溶性氮含量测定：凯氏定氮法。 肽基氮含量测定：水解物上清液中肽基氮含量占原料总氮量百分比，即水解产物中可溶性氮含量与氨基氮含量之差。 1.4.3 巯基(SH)含量分析 参照Beveridge等SH分析方法20。 巯基含量分析：吸取0.5mL酶解液，加入2.5mL TrisGly8MUrea溶液，再加入0.02mL DTNB溶液(4mg/mL用TrisGly缓冲液配制)，迅速混合后在25下保温反应30min，用分光光度计测定它在=412nm下吸光度值(A412)，同时测定空白值(以蒸馏水代替样品测定)。每组样测定3组，取平均值为最终结果。计算公式如下： mol SH/g=73.53A4
