《荧光原位杂交和用引物介导的原位标记(PRINS)sop》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光原位杂交和用引物介导的原位标记(PRINS)sop（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、名称：荧光原位杂交(FISH)和用引物介导的原位标记(PRINS)操作规程关键词：荧光原位杂交、引物介导的原位标记目的：熟悉荧光原位杂交和用引物介导的原位标记的实验方法背景知识：选填项目原理：选填项目主体内容：仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。FISH试剂(1) 1XPBS:由10XPBS溶液稀释而成，储存于4C；(2) 20XSSC (pH7.0)；(3) 2XSSC，由20XSSC溶液稀释而成；(4) 25mg/ml蛋白酶K消化液。(5) 变性液(70%甲酰胺+2XSSC, pH7.0)： 4ml 20X
2、SSC； 8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新 鲜配制。(6) 杂交后洗涤液：20XSSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前 升至室温。实验步骤1、脱蜡：1) 二甲苯脱蜡3次，每次5min；2) 100%酒精两次，每次2min；3) 移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理：1) 每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2xSSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽 中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2) 37C水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37C孵育20min。3) xSSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。4) 梯
3、度酒精脱水(-20C预冷)。3、变性：1) 每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2) 78C水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3) 78C孵育 8min；4) 即移入-20C预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20C预冷 酒精内，每缸2min；5) 空气干燥。4、杂交：1) 准备探针；2) 取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴105探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37C孵育12h16h。杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43C预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2xSSC（37C）洗两次，每次 10min；8）切片放人染色
4、缸的1XPBS内待检测，勿使切片干燥。检测：9）从1XPBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4 张切片。10）每张切片使用30Ml-60pl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1XPBS的染色缸。1XPBS室温下洗3次，每次2min。扩增：12）从1XPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30pl-60pl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1XPBS的染色缸。1XPBS室温下洗3次，每次2min；15）从1XPBS中取出切片，斜置切片使液体排
5、出；16）每张切片滴30pl-60pl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1XPBS室温下洗3次，每次2min。5、细胞核染色：1）张切片加10pl-20pl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育25ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20C冰箱。切片在染色之后1h内可以在 显微镜下观察。PRINS步骤1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；2、用0.2mol/L盐酸处理5min；3、蛋白酶 K（25|jg/m1）消化 37C 15min；4、分别用80%，95%和100%酒精脱水，室温干片；5、加 PCR 混合液 25|jL（10mmol/L Tris-
6、HCl, 50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2,各加 200pmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5pl，引物 250ng，Taq DNA聚合酶 2U），加盖 片；6、94C变性5min后置入65C湿盒中5min；7、用 0.1XSSC 液，65C洗 5min；8、片于 65C 10s20s；用 4XSSC-0.1%吐温 20 液 42C洗 5min，2 次；9、经Buffer I液洗后滴加20%羊血清封闭30min；10、加地高辛抗体复合物（1:500）室温下2h；11、Bufferlll液洗 5min；12、用BCIP-NBT显色1h2h，在镜下控制，终止显色；13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。
