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1、2.5细胞裂解细胞从培养皿上被刮下来之后，在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次 洗涤用10mlPBs充分重悬细胞，在4“c下5009离心5min。所有操作在冰上进行。 最后一步洗涤把细胞转移到l.smlePpendorf管中。把细胞充分重悬在TAP细胞 裂解液中。根据细胞量决定裂解缓冲液的体积(一般每10川细胞用100川一 200 川TAPBu价r)。放置于冰上30min，每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分 悬浮。在4OC下用100009高速离心15min，把上清转移到新的试管中进行下一 步实验，丢弃沉淀。2.13细胞自噬活性的检测我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿
2、处理，二药物RaPamycin处理。对 于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细 胞脱离培养皿，加入15mlEBss(用量根据培养皿的大小而定)连同2林M的ED64和pePstatin。 在37“C培养箱中培养2 4h。对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为 500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培养12h。细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一 条是通过转染GFP 一 LC3，再用荧光显微镜观察 LC3在细胞质中的聚集。二是用 westemblotting和LC3的抗体，检测细胞内源LC3n的增加。 对于荧光显微镜分析，
3、在U20S细胞中转染GFP 一 LC3, 24h之后，把细胞继代培养在有盖玻片的6孔板中，诱导自噬，吸去培养液，用PBS小心润洗玻片1次，在每个孔内加入3%的多聚甲醛，在室温下闭光摇晃培养玻片 20min。用PBS洗涤玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃 10min，用固定液把盖玻片固定在载玻片上，在室温下干燥1min之 后用荧光显微镜观察。 对于westemblotting，从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的 细胞，加入1SDS蛋白上样缓冲液，并用超声波处理直到不粘稠为止，95“e煮沸样品5min， 室温下高速(100009)离心5min，通过SDs 一 pAGE并用LC3的抗体(s
4、igma)进行westemblotting 检测，自噬活性越高的细胞内LC3n的条带浓度越高。1.2.1自噬体检测实验分为3组，分别为自噬诱导组，自噬抑制组和雷帕霉素组。自噬诱导组:1x105 RAW264.7细胞培养至对数生长期，加入50 nmol/L雷帕霉素作用3h,然后按感染复数 (MOI) =1 : 10比例加入1x109 CFU/L的H37Rv菌株培养3h, PBS (pH7.4)缓冲液洗脱3 次以洗脱未结合的H37Rv菌株。自噬抑制组:RAW264.7细胞加入自噬抑制剂3MA (600 mg/L)作用36 h,然后按MOI=1 : 10比例接种H37Rv菌株作用3h。雷帕霉素组：R
5、AW264.7 细胞培养至对数生长期，加入50 nmol/L雷帕霉素作用3h。上述各组细胞胰酶消化后收集,20g/L锇酸固定过夜，透射电镜观察自噬体的形成。1.2.2菌落形成单位（CFU）检测自噬诱导组和自噬抑制组细胞胰酶消化后收集，加入2倍体积双蒸水裂解细胞,7 000 r/min离心，收集沉淀，重悬后1 : 107稀释，取100山悬液接种于7H10培养基,37C培养21 d进行菌落计数。2结果2.1自噬体检测雷帕霉素作用于RAW264.7细胞后，以H37Rv菌株感染细胞，透射电镜可发现细胞中 有大量由单层膜组成的自噬囊泡出现，同样雷帕霉素组也可诱导产生自噬体形成。而以自噬 抑制剂3 MA处
6、理RAW264.7后,细胞中未发现自噬囊泡（图1）。2.2 CFU检测H37Rv菌株感染细胞后裂解，稀释后接种于7H10培养基，经过21 d培养，计数CFU。 自噬诱导组H37Rv菌株CFU为4.120.32,而3MA处理后CFU为6.430.11,两组相比有 统计学意义（P0.05）。这些结果说明自噬体产生后可对胞内感染的H37Rv菌株有一定的 清除作用。1. 3免疫荧光法观察长春瑞滨给药后A549细胞内LC3蛋白表达的变化A549细胞接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片于6孔板中，待细胞贴壁后 加入一定浓度的长春瑞滨同时设立阴性对照和空白对照，培养不同时 间（O24）h后，于盖玻片上4%多聚甲醛固
7、定细胞15 min，固定的细 胞用PBS洗两次后，加入0. 25%TritonX100冰上放置5 min，PBS 洗2次，然后加入1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）处 理30 min，加入I%BSA稀释的羊抗AMAPlLC3II（1： 200），4 oC 孵育过夜，次日用PBS洗3次后，加）LFITC标记的兔抗羊IgG（1%BSA 以l：20的比例稀释），室温下避光孵育30 min，PBS再次洗涤细胞后， 用lOg/mL PI和Rnase A室温下细胞核DNA染色30rain，激光共聚焦 显微镜下观察。1. 4 LC3免疫荧光染色后流式细胞仪对细胞自噬进行定
8、量检测按上述1. 3方法收集细胞（同 时设立空白对照及阴性对照组）后用4C预冷的PBS洗2遍，然后用4%不含甲醇的甲醛冰上固 定细胞2次后，PBS洗2次，80%冰乙醇固定，置一20C冰箱过夜，固定的细胞用PBS洗2次， 然后加入I%BSAl00IXL重悬细胞，加入I%BSA稀释的兔抗人MAPLC311（1： 100），4 oC 孵育过夜。次Et细胞用PBS洗3次后，加入F11C标记的羊抗兔IgG（I%BSA以1： 20的比例稀释）， 室温下避光孵育30 min，PBS再次洗涤细胞，流式细胞仪检测LC3荧光水平的变化，反应自噬 的比率。平衡盐溶液配制平衡盐溶液是由Ringer根据生理盐水首先创制
9、的，由无机盐和添加成分葡萄糖等组成。平 衡盐溶液是为了使哺乳动物细胞短期处于存活状态，而不是促进其生长。平衡盐溶液是用来 洗涤组织和细胞，稀释作用于细胞的试剂和药物等，维持生理的pH和渗透压。1. Hanks平衡盐溶液Hanks平衡盐溶液是含磷酸盐的缓冲溶液，在暴露于空气的状态下，能够维持生理的pH。 因此，经常作为酶消化细胞或组织和最终将细胞置于培养基中之前的洗涤细胞过程的首选溶 液。Hanks 平衡盐溶液配方 Hanks Balanced Salt Solution （HBSS）组分分子量浓度（gm/L）摩尔浓度（mM）无机盐：氯化钾（KCl） 75 0.4 5.33磷酸二氢钾（KH2PO
10、4） 136 0.06 0.44碳酸氢钠（NaHCO3） 84 0.35 4氯化钠（NaCl） 58 8 138磷酸氢二钠（Na2HPO4） 142 0.048 0.34其它组分：葡萄糖（Glucose） 180 1 5.6酚红（Phenol Red） 398 0.011 0.032. 磷酸盐缓冲溶液Dulbeccos 磷酸盐缓冲溶液配方 Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline （D-PBS）（不含钙、 镁离子）组分分子量浓度（gm/L）摩尔浓度（mM）氯化钾（KCl） 75 0.20 2.67磷酸二氢钾（KH2PO4） 136 0.20 1.47氯化钠（NaCl） 58 8.00 138.00磷酸氢二钠（Na2HPO4） 142 1.15 8.10
