《2022年DB21∕T 2138-2013 仿刺参基因识别检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年DB21∕T 2138-2013 仿刺参基因识别检测方法（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ICS67.120.30B50备案号：DB21辽宁省地点标准DB 21/T 2013仿刺参基因识别检测方法Identification of Apostichopus japonicus gene detection method（本稿完成日期：2013.2.1）2013 - * - *发布2013 - * - *施行辽宁省质量技术监视局发布前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由大连市产质量量监视检验所、大连标准检测技术研究中心提出。本标准由大连市质量技术监视局归口。本标准由大连市产质量量监视检验所、大连标准检测技术研究中心负责起草。本标准主要起草人：杨滴、刘彦泓、刘
2、岑杰、夏元凤、刘紫群、姜俊、于利军、董广彬、郝苗、闵健、李鹏。本标准于2013年*月*日初次发布。仿刺参基因识别检测方法1 范围本标准规定了仿刺参基因识别检测方法的术语、定义、缩略语、原理、试剂、主要仪器、试样制备、操作步骤、结果断定。本标准适用于仿刺参基因识别检测。2 标准性援用文件以下文件中的条款通过本标准的援用而成为本标准的条款。但凡注日期的援用文件，其随后所有的修正单（不包括订正的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓舞依照本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。但凡不注日期的援用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法GB/T 1
3、9495.2 转基因产品检测 实验室技术要求3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义以下术语和定义适用于本标准。3.1.1仿刺参（Apostichopus japonicus）为棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯首目、刺参科、仿刺参属的动物，俗名刺参。分布于北太平洋区、包括俄罗斯、日本、朝鲜半岛沿岸以及中国大陆的辽宁、河北、山东、江苏等地，常见于波流静稳、海草繁茂和无淡水注入的港湾内以及底质为岩礁或硬底。3.2 缩略语以下缩略语适用于本标准。3.2.1 Realtime PCR：实时荧光PCR（Real-time polymerase chain reaction）3.2.2 DNA: 脱氧核糖
4、核酸（deoxyribonucleic acid） 3.2.3 Tris: 三（羟甲基）氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane）3.2.4 Ct值：每个反响管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。3.2.5 FAM: 6-羧基荧光素，荧光基团（6-carboxyfluorescein） 3.2.6 TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明，淬灭荧光基团（6-carboxytetramethylrhodamine）3.2.7 18s rRNA: 真核生物18s核糖体RNA基因 4 原理依照仿刺参线粒体保守基因片段，设计引物及荧光探针。利用实时荧光PCR方法识别仿刺
5、参特异性基因。实时荧光PCR方法是PCR扩增时在参加一对引物的同时参加一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完好时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团别离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子构成，实现了荧光信号的积累与PCR产物构成完全同步。5 防污染措施检测过程中防止穿插污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。6 试剂和主要仪器6.1 试剂除另有规定外，所有试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T 6
6、682规定的一级水。6.1.1 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；6.1.2 三氯甲烷；6.1.3 无水乙醇；6.1.4 异丙醇；6.1.5 乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）；6.1.6 盐酸（HCL）；6.1.7 氢氧化钠(NaOH)；6.1.8 苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1，体积比）；6.1.9 三氯甲烷+异戊醇（24+1，体积比）；6.1.10 乙酸钠溶液：3 mol/L乙酸钠溶液，乙酸调理pH为5.2；6.1.11 Tris 饱和酚；6.1.12 TE缓冲液：Tris0.01mol/L, Na2 EDTA0.001 mol/L,用HCL或NaOH调理pH为8.0。6.2 主要
7、仪器6.2.1 实时荧光PCR仪；6.2.2 超净工作台；6.2.3 消毒灭菌锅；6.2.4 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；6.2.5 高速冷冻离心机；6.2.6 低温冰箱；6.2.7 纯水器；6.2.8 微量进样器。7 试样的制备采样工具（剪刀、镊子、研钵）应通过180，2h高温灭菌。称取约100g样品，将样品在研钵中研碎。8 操作步骤8.1 DNA提取8.1.1 苯酚-三氯甲烷法取0.2g研碎好的样品放入2.0mL离心管，参加400L TE缓冲液，于65水浴中溶解10min，上下颠倒混匀。参加与溶液等体积苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1）溶液，摇摆混匀10min。12000r/mi
8、n室温离心10min，将上清液转移至另一个2mL离心管中。参加上清液等体积氯仿+异戊醇（24+1）溶液，摇摆混匀10min。12000r/min室温离心10min，小心汲取上清液。参加上清液1/10体积乙酸钠溶液、等体积异丙醇，混匀后室温静置10min。12000r/min室温离心10min，弃去上清液。70%乙醇洗涤沉淀23次，枯燥DNA。50L TE缓冲液溶解沉淀，4保存。8.1.2 试剂盒法使用不同的商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进展操作。8.2 DNA浓度和纯度的测定取5L DNA溶液，用TE缓冲液稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测260nm和280nm
9、处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1）计算： (1)式中：CDNA浓度，g/L；A260 nm 处的吸光值；N核酸稀释倍数。当A260 /A280 比值为1.71.9之间时，适宜实时荧光PCR扩增。8.3 实时荧光PCR反响8.3.1 引物和探针实时荧光PCR用引物序列见表1。表1 实时荧光PCR用引物序列 检测基因引物序列适用范围18S5CCTGAGAAACGGCTACCAT 3真核生物（内参照基因）5CGTGTCAGGATTGGGTAAT 3线粒体5GACAATTTTCGCCCGACACT 3仿刺参特异性基因5AAGTTGGTTGGGAAAATGTAAAGG 3实时荧光PCR
10、用探针序列见表2。表2 实时荧光PCR用探针序列 检测基因探针序列适用范围18S5(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT -(TAMRA)3真核生物（内参照基因）线粒体5(FAM)-ATTTATCCCCCTACAGTTAGTTTCCT-(TAMRA) 3仿刺参特异性基因8.3.2 实时荧光PCR反响体系实时荧光PCR反响体系见表3。表3 实时荧光PCR反响体系试剂名称最终浓度10PCR缓冲液(不含氯化镁)1氯化镁溶液(25mmol/L)2.5 mmol/LdNTP溶液(各2.5 mmol/L)各0.2 mmol/LUNG酶0.075U上游引物(20mol/L)0.2mol/L下游
11、引物(20mol/L)0.2mol/LTaqMan探针(10mol/L)0.1mol/LTaq酶2.5UDNA模板(100ng/L)300ng补水至50L8.3.3 实时荧光PCR反响条件 实时荧光PCR反响参数：95预变性，30s；95变性5s、60延伸31s，共40个循环。注： 不同仪器可依照仪器要求将反响参数作适当调整。8.3.4 对照阳性对照：仿刺参基因组DNA、真核生物基因组DNA阴性对照：已经知道以不含仿刺参基因的样品提取的DNA空白对照：双蒸水（dd H2O）9 结果推断与表述9.1 结果分析条件设定直截了当读取检测结果。阈值设定原则依照仪器噪声情况进展调整。9.2 结果断定9.
12、2.1 对照结果空白对照：外源基因检测Ct值40，内参照基因检测Ct值40；阴性对照：外源基因检测Ct值40，内参照基因检测结果20Ct值30；阳性对照：外源基因检测Ct值36。9.2.2 检测结果的断定待测样品外源基因检测Ct值40，内参照基因检测结果20Ct值30，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可推断该样品未检出仿刺参特异性基因。待测样品外源基因检测Ct值36，内参照基因检测结果20Ct值30，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可推断该样品检出仿刺参特异性基因。待测样品外源基因检测结果36Ct值40，内参照基因检测结果20Ct值30，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，应再次实验。如再次实验外源基因检测结果36Ct值40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可推断该样品未检出仿刺参特异性基因。9.3 结果表述检出仿刺参特异性基因；未检出仿刺参特异性基因。_
