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1、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体长距离空气传播假设的证实Scott Dee,* Satoshi Otake, Simone Oliveira, and John DeenSwine Disease Eradication Center, University of Minnesota College of Veterinary Medicine, 385C Animal Science/Veterinary Medicine Building 1988 Fitch Avenue St. Paul MN 55108 , USA*Corresponding author: Email: dee
2、xx004umn.edu 本文评估了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体通过空气进行长距离传播的方式及能力。利用300头生长育肥猪进行试验，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒MN-184毒株和猪肺炎支原体 232毒株，在随后的50天内，利用一个液体气旋收集器在距离试验猪群一定距离处收集空气样品。利用PCR分别检测样品中是否存在PRRSV的RNA以及猪肺炎支原体的DNA，如果结果显示阳性，需要对其做进一步的确定。收集的306份样品中有四份（1.3%）为PRRSV RNA阳性，有六份（1.9%）是猪肺炎支原体DNA阳性。PRRSV阳性样品在距离试验猪群西北方向4.7公里的位置处重新发现。四份猪肺炎支原体样
3、品在西北采样点处获得：其中两份在距离试验猪群大约2.3公里处，另外两份在距离大约4.7公里处。剩余的两份样品中，其中一份在东南方采样点获得，另外一份在西南方采样点获得，这两个位置都距离试验猪群大约4.7公里处。四份PRRSV阳性样品中含具有感染性的病毒，该病毒与试验猪群接种用的MN-184毒株同源性为98.8%。六份猪肺炎支原体阳性样品与猪肺炎支原体232毒株的同源性为99.9%。以上结果证实了之前的假设，即在一些猪群中，重要病原体的长距离空气传播是可以发生的。关键词： 空气 传播 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪肺炎支原体1. 引言家畜病原体通过气溶胶的形式进行远距离传播的能力已经争议了许多年。在
4、一些著作中已经有一些关于远距离空气传播的报道并列出了一定数量的细菌和病毒，包括口蹄疫病毒、伪狂犬病毒以及猪肺炎支原体。关于口蹄疫病毒，利用实际爆发疾病的数据结合疾病建模技术预测，以气溶胶的形式在陆地上能够传播60公里，在海洋地区能够传播100到280公里。类似地，在印第安纳州伪狂犬病毒通过空气传播扩散至10个养殖场，养殖场之间的距离预测在1.3-13.8公里之间。最后，关于猪肺炎支原体在猪场间传播的流行病学研究调查显示，空气传播是一个重要的风险因素，一个养殖场要维持其无猪肺炎支原体状态，与其他感染养殖场之间的距离应为3.2公里。沿着这些思路，能够很好的证明特殊的气候条件对增强微生物在气溶胶中的
5、存活以及增强远距离空气传播具有重要的影响。以口蹄疫为例，已经被计算过，在相对湿度为60%，风速为10 米每秒（m/s）时，病毒能够传播100 公里以上。其他参数被怀疑为该病原空气传播的风险因素，包括增加的云层覆盖率（70到90%）引起的太阳紫外线福照度的下降。德国北部的畜群中分离的伪狂犬病毒同源毒株出现在丹麦南方猪群，在传播期间，以上有影响的各种天气条件均有所呈现，包括一个标记的气流（90%到140%的增加），定向从南到北流动，平均气温高出常温的2到6度，降水量增加以及云层覆盖度增加。在印第安纳州爆发伪狂犬的模型中利用的条件包括从感染养殖场到易感养殖场的定向风，风速在5到6 m/s、低温（低于
6、常温-11到-6），相对湿度为85%，伴有雾或雨形式的降水。最后，关于猪肺炎支原体，空气传播引起的疑似病例数量容易在秋冬季节及凉爽潮湿的天气中有所增加。另一个重要的病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒。在丹麦评估关于PRRSV对母猪群传播的风险因素中，Mortensen指出空气传播是一个频繁的传播方式，由Pitkin等最近验证了一个假设，他证明了以气溶胶的形式传播病毒能够达120米。然而，目前还不能使用关于PRRSV远距离空气传播的数据以及与其相关的气象学条件。Mondaca等人假设主风的存在可能会增强PRRSV在农场之间的移动。然而，尚未得出确切结论。为了更好的理解气候对气溶胶中PRRSV存活的作
7、用，Hermann等报道气溶胶中PRRSV的半衰期的范围：温度为5，相对湿度为17%时193分钟，温度为41，相对湿度为73%时4分钟。此外，利用一个猪生产区的模型，Pitkin等人报道PRRSV在空气中存在的相关条件，包括低速度的定向风、较低的相对湿度以及不断升高的气压。尽管这些信息提供了PRRSV通过气溶胶途径传播及其相关气象条件的初步理解，在得到关于病原潜在的通过气溶胶途径长距离传播的结论之前，仍需要更多的数据。此外，需要关于猪肺炎支原体的类似信息来证实之前研究中所得到的结论。因此，本研究的主要目的是提供关于猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体长距离空气传播的证据，以及鉴定与这些事件相关
8、的气候条件。本研究是以假设在给予正确的条件下，两个病原长距离空气传播可以发生为基础的。2 材料和方法2.1 试验设计2.1.1 描述试验地点和实验接种 这项研究利用了明尼苏达大学猪病净化中心（SDEC）研究场所以及周围44平方公里，该大学位于美国中西部地区的明尼苏达州。研究场所地势平坦，海拔高度在304到314米之间。土地主要由农田组成，用于种植玉米、大豆和小麦，草地用于牛的放牧，距离SDEC最近的猪场是北方16公里处，而且确定没有猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体感染。本项研究调查时间超过了50天，2008年9月30日开始， 2008年11月18日结束。在SDEC试验点，生长育肥舍，机械通
9、风，饲养了300头生长育肥猪（25到120千克），作为周围区域PRRSV和猪肺炎支原体气溶胶传播的源头。在研究开始的前两周，在300头猪中抽取60头通过气管接种10 mL猪肺炎支原体232，剂量为每头猪每毫升105变色单位。两周后，取300头中的100头通过鼻粘膜接种2mLPRRSV MN-184，剂量为每头2 104 TCID50 。毒株选择是参照之前的相关研究：该毒株接种的实验猪在气溶胶中排毒的能力和对阴性猪的传播感染率显著较高。接种病毒后，在接毒后的2天，取100头中10头猪采集血液样品，通过PCR检测血液中PRRSV RNA的存在，以确定试验PRRSV成功感染。同样地，确定猪肺炎支原体
10、的感染，在接种的60头猪中取10头，在接种后14天采集鼻拭子，通过PCR检测样品中猪肺炎支原体的DNA。另外，逐日观察PRRSV（体重减轻、直肠温度大于40以及升高的死亡率）和猪肺炎支原体（咳嗽）存在的临床症状。为了维持两个病原在动物群中的循环，3组分别20 头PRRSV和猪肺炎支原体阴性猪每2周引入动物群中一次。每组20头猪中取10头检测血液样品以及引进动物群14天后检测鼻拭子，以验证在研究进行期间病原的传播。在整个研究过程中，按照明尼苏达大学动物福利组织和使用委员会认可的协议对实验动物进行照顾。2.1.2 空气采样方案为了评估猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体潜在的长距离空气传播，设计了
11、在SDEC周围44平方公里内样品采集的区域，分为16个采样点，分别从中心设施想四个方向覆盖：北方、南方、东方、西方和4个中间方向：西北方、东北方、西南方和东南方。在整个50日研究期间，计划采集样品点为东、南、西、北距离动物群设施为1.7和3.3公里处，西北（NW）、东南(SE)、东北(NE)、西南(SW)在距离动物群设施2.6和4.7公里处（图.1）。距离畜群设施最远的采样点（3.3公里和4.7公里）定义为A，例如NW-A，然而距离设施较近的点定义为B，例如NW-B。利用指定的农场车辆的计程表确定畜群设施到每个采样点的距离，每个采样点用彩色的塑料旗帜标记。每日空气样本在畜群源设施预设的方向进行
12、采样，与主风方向一致。这个决策是以Pitkin等人研究结果为基础的，他们先前证明，当主风从饲养PRRSV感染动物的设施流动时，检测出PRRSV阳性气溶胶的可能性会高出6.4倍。因此，如果主风向是来自西北方向，工作人员应该在畜群源设施下风口在SE-A和SE-B采样处采集空气样本。利用HOBO气象站确定风的方向，气象站位于研究地点，紧邻畜群源设施。关于空气样本的采集，应利用样本大小表格和一个PRRSV或者猪肺炎支原体阳性样本的预计大于等于2%的流行率，空气样本能量为0.8，为0.05，共计算在A距离点一个样本的大小为149个，在B距离点样本的小大也为149个，最终一共298个长距离空气样本。对于采
13、集空气样本，利用一个液体气旋收集器可以每分钟捕捉400升的空气，之前评估用于检测PRRSV在气溶胶中仪器的敏感性发现，其敏感性为1101 TCID50/mL。贯穿整个研究中，每日样本收集的时间段为上午五点到十点，没半个小时采样一次。每日计划在制定的A采样点，从五点到七点采集三到四个样本，在制定的B采样点，从七点十五到九点十五采集三到四个样本。将仪器运送至指定样本采样点，气旋收集器放在农场车辆的驾驶室中，借助一个木质的盒子，将仪器抬高座位25厘米，利用车辆的蓄电池作为动力。车辆驾驶室的大小为高1.5米、宽2米、长1米，能够作为捕获进来气体的场所。在到达样本采集点时，车辆要靠乘客一侧停车，驾驶室正
14、对主风的方向。作为空气的一个入口，乘客一侧的窗户要全部打开，驾驶员一侧的窗户打开大约5厘米作为空气的出口。在30分钟采样过程中，空气微粒子进入气旋收集器的采集器中，用10毫升3%胎牛血清的最低限度基础培养基清洗。在没30分钟样品收集后，每天取5毫升小份基础营养液至于冰上储存，知道所有检测完成。为了将污染风险降至最低，研究人员收集的空气样本中，更换了手套和空气净化器。该仪器是喷洒烷基二甲基苄基氯化铵（来沙尔、利洁时、韦恩、新泽西、美国），利用新鲜的基础培养基清洗收集器，用一次性纸巾弄干，利用无菌涤纶棉签擦拭。拭子储存在无菌的塑料管中，含有3%胎牛血清的基础营养液，储存于冰上。在进行远距离空气采样
15、的同时，每天上午九点半到十点采集畜群源的30分钟空气样本。对于这些样本的收集，气旋收集器要放在畜群源设施的外面，距离指定的排气扇1米。所有的样本储存在-20直到检测。2.1.3 对照研究开始之前，采取一些列的对照验证收集方法成功获得雾化PRRSV(阳性对照)的能力，以及证明在采样过程中机械污染的不足（阴性对照）。对于阳性对照，利用改造的活PRRSV疫苗形成各种不同浓度的人工PRRSV气溶胶。一百毫升疫苗病毒稀释10倍至1升生理盐水，产生浓度范围为1101 TCID50/L to 1107TCID50/L。研究开始之前，通过病毒滴度的方法验证每个稀释度的病毒含量。为了雾化病毒并进入车辆驾驶室，冷
16、雾设施的水槽中充上一升每种浓度的病毒，开始为1101 TCID50。设备设定流速为每分钟200毫升，放在离地面一米的位置，距离车辆一米，管口为45度角。利用一个五分钟释放期，引起一升稀释疫苗雾化。随着雾化病毒的释放，气旋收集器可以运行三十分钟，从收集器中取出一个五毫升的小份储存于20。阴性对照的目的是仅利用盐水将程序重复七次。在整个研究中，设立日常环境对照验证车辆和气旋收集器中不存在残留的遗传物质。在日常采样中，整个车辆的驾驶室会用烷基二甲基苄基氯化铵喷雾消毒，用一次性纸巾擦干。然后收集驾驶室内表面的拭子，包括座位(拭子1个)、方向盘(拭子1个),加速器(拭子1个)、制动器(拭子1个)和仪表板(拭子1个), 以5:1合并作为一个单一的样品检测。驾驶室的窗户关闭，车辆在研究地点的车库内存放过夜。然后，每日采集样本之前，收集一个来自车辆驾驶室的三十分钟样本，验证在驾驶室内不存在残留的PRRSV和猪肺炎支原体。在这个过程中，驾驶室的窗户保持关闭，车辆保持
