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1、细胞培养中支原体污染的问题原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2u)并独立生活的微生物.约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变,在光境下不易看清内部构造。电镜下观测支原体膜为三层构造其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小,且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、 2或葡萄糖,每一种支原体均有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(H7.680)，对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞
2、后培养液可不发生混浊.多数状况下细胞病理变化轻微或不明显，细微变化也可由于传代、换液而缓和因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢甚至从培养器皿脱落。为拟定有无支原体污染可做如下检酗：相差显微境检测:将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，2h后取出,用相差油镜观测.支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hechst38,可使支原体内具有的DNA着色,染色后用荧光显微镜观测。具体措施如下:一方面将细胞接种盖玻片上,在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Has液漂洗一下，用l: 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗置于用生理盐
3、水配浓度为50pg/ml的Hoe 33258中染色0n。染色后用蒸溜水洗2min向细胞面滴加pH55磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观测。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。电镜检查;用扫描电镜措施简便迅速也可以运用透射电镜。DNA分子条文检查或支原体培养等措施：检出率高.但措施较为复杂支原体是一类缺少细胞壁的原核细胞型微生物,大小一般在03-0.5之间，呈高度多形性,有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞,也不同于病毒。支原体用一般染色法不易着色,用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长,营养规定比细菌高。细胞培养(特别是
4、传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到6%,支原体感染发生后芨谋湎赴腄NA,NA及蛋白体现，又不能通过可视法对其进行检测,并且它对细胞的生长率影响较小,不易引起注意。国内外研究表白，95以上是如下四种支原体:口腔支原体（M.rale）、精氨酸支原体（.rgnini)、猪鼻支原体（.yrhinis）和莱氏无胆甾原体（A.aidlwii),为牛源性。以上是最常用的污染细胞培养的支原体菌群，但可以污染细胞的支原体种类是诸多的,国外调查证明,大概有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同步污染两种以上的支原体。支原体污染的来源涉及工作环境的污染、操作者自身的污染（某些
5、支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、污染支原体的细胞导致的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。组织细胞培养工作中，重要从如下几种方面来避免支原体的污染:控制环境污染;严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用措施有抗生素解决、抗血清解决、抗生素加抗血清和补体联合解决。支原体最突出的构造特性是没有细胞壁,一般来讲,对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素(poymyn）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有克制活性及常用于支原体感染
6、治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及某些氟喹诺酮;其她类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小克制作用，因此常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。Invivoe公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Pamoci能有效地杀灭支原体，不影响细胞自身的代谢，并且用-lasmo解决过的培养细胞，不会重新感染支原体。红霉素有效，并且不影响细胞生长。细胞刚开始被支原体污染的时候，细胞生长极为缓慢,并且状态不好，细胞之间及底部总有某些亮晶晶的颗粒状物质，换液后好些,但过2天又会增多,培养液清亮，严重时象一层细沙铺在瓶底。刚开始觉得是消化过头引起的细胞的碎片和细胞内的颗粒,后来发现与胰酶消化无关。使用红霉素（就
7、在医院的门诊购买,很便宜)后这种现象明显好转,背景干净，细胞生长不久，状态明显好转，但仿佛红霉素不能完全根治支原体感染，停药后一段时间可以复发，但如果细胞很重要有无多余的细胞时可以考虑一试。支原体是细胞培养中最常用的，干扰实验成果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在继续使用。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11的细胞受到支原体污染。因此,对支原体污染应严加防备。用卡那霉素避免支原体污染有效。检测措施:1 相差显微镜检测;2低张解决地衣红染色观测； 3 DNA荧光染色法； 电镜检测；5 3-H胸腺嘧啶掺入法； 聚合酶链反映法； 7 免疫学措施； 8 支原体的培养。
8、支原体污染的细胞，采用的补救措施:1 抗生素排除法:可以用-10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用2-8小时,再换入常规培养液，有时也许有效。推荐用量：庆大霉素00ug/ml,四环素g/ml ,卡那霉素50ug/。对于支原体污染抗生素应用，避免性应用比污染后使用好。 加温除菌:根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于4度中作用-10小时可以杀灭支原体。但由于度对培养细胞自身也有较大的影响，故解决前,应先进行预实验,拟定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的解决时间 化学试剂BM-Ccln，除体外培养癌细胞中支原体污染具体措施：1 选用抗支原体药物(B-yclin-1、)，磷
9、酸缓冲液配制,溶液抽滤除菌,04保存。2 细胞解决过程:细胞传代同步加-Cyclin-1g/ml,37培养3天;胰蛋白酶消化、传代，加入BM-cin2 5g/m,37培养3天；继续传代追加BM-Cyclin-2 5g/ml一次,培养4天(如细胞污染严重可反复上述解决过程)弃药液,D-Hnks液洗2次，胰蛋白酶消化传代,进行常规培养。 在细胞检测或实验前，最佳再用常用量的倍庆大霉素或卡那霉素作短时间解决,每天360分钟。支原体的污染是目前细胞实验室比较普遍存在的问题,用药物来杀灭支原体虽是一种重要措施，毕竟是一种补救措施，并且清除后,支原体仍可重新污染细胞。因此,重要的还在于避免,如严格选用无支
10、原体污染的牛血清,保持细胞培养间干净和严格无菌操作等Mycoplama国内重要有三种译名,医学文献译为“支原体”（分枝原体,枝原体，类菌质体）,动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多,有8余种,分为两个属:一为支原体属(ycolsma),有几十个种;另一为脲原体属(Uealasma），仅有一种。与人类感染有关的重要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁,多呈不规则球状、长丝状,可分枝,营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可导致多种疾病。 细胞培养(特别是传代细胞)被
11、支原体污染是个世界性问题。国内外研究表白，95以上是如下四种支原体:口腔支原体(M.ole)、精氨酸支原体(M.arginn)、猪鼻支原体(Mhyorhinis）和菜氏无胆甾原体(A.idlawii)，为牛源性。国外调查证明,大概有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同步污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源涉及工作环境的污染、操作者自身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞导致的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及某些有害有毒物质没有抵御能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染(如细菌、真菌、支原体
12、、病毒等)、无其她对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(如抗体、补体)。对于天然培养基,污染重要来源于取材过程及生物材料自身,应当严格选材,严格操作。对于合成培养基，污染重要来源于配制过程，配制所用的水,器皿应十分干净，配制后应严格过滤除菌。由于体外培养细胞自身没有抵御污染的能力,并且培养基中的抗生素抗污染能力有限,因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，由于它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉,实则细胞手到多方面潜在影响,如引起细胞变形,影响DA合成,克制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从如下几方面来避免支原体的
13、污染:控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。 抗生素重要用于消毒培养液，是培养过程中避免微生物污染的重要手段,也是微生物污染不严重时的“急救”措施。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多,培养细胞需要频繁改善营养环境才干支持长期传代培养时,应当怀疑支原体污染。支原体污染难以观测特殊的外观变化，培养液也不浑浊。 支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要清除支原体,常用措施有:抗生素解决、抗血清解决、抗生素加抗血清和补体联合解决。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素,如内酰胺类
14、、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药。对支原体最有克制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等,氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的克制作用。必要时更换所有培养用物。一般,滤过除菌的措施对支原体是没有作用的。 由于某些微生物，如支原体，病毒等能通过滤膜，因此过滤药物仍潜在被外源微生物污染的危险，近年来，60C辐射灭菌技术在医药、食品等领域广泛应用,由于辐射灭菌可以彻底杀灭所有微生物。有实验证明以2Mad辐射解决的各培养基样品达到了无菌规定，经多批培养实验，辐射灭菌安全可靠；辐射灭菌的培养基营养性能不低于过滤组，证明辐射灭菌对培养基性能无不良影响;对血清的辐射灭菌实验效果也表白0射线不影响培养效果。把干粉培养基经无菌操做定量分装于灭菌容器内,辐射后以干粉原型贮藏，不仅培养基的纯净性得到保障，并且营养性能较过滤后以水溶液形式保存更稳定，对谷氨酰胺等此类水溶液不稳定者特别合适。目前,有专门做支原体检测的试剂盒,可以用细胞滴片检测。市场上已有了新一代支原体抗生素Plamcin（IvivoGen公司）,能有效的杀灭支原体，又不影响细胞自身的代谢，并且解决过的细胞不会重新感染支原体。此外,配合支原体检测试剂盒（市场上有售，如美国IC公司的产品),可以协助尽快发现支原体的污染。
