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1、第四章离心技术离心机是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或 漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。离心机的种类繁多，用途各异，本章 只介绍生物离心机的基本原理、方法及其在医学检验上的应用。一、离心理论1、离心分离的原理Ff将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病 毒和生物大分子等称为颗粒。每个颗粒 都有一定大小、形状、密度和质量。当离 心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中 发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在 颗粒上的力的大小和力的方向有关。颗粒 除受到离心力(Fc)外，还受到颗粒在介质 中移动时的摩擦阻力(Ff)、与离心力方向 相反的浮力(fb)、颗粒
2、处于重力场之下的 重力(Fg)和与重力方向相反的浮力(Fb)。各 力的作用方向见图41。此外，颗粒还受 到周围介质小分子的作用力，当颗粒很小 时，介质分子对颗粒的作用力十分明显，要使这种小颗粒沉降，需要更大的离心力。本节只讨论 比介质分子大得多的颗粒，因此介质作用力不予考虑。下面将对各个力作详细的分析。1) 离心力离心力(Fc)的大小等于离心加速度2R与颗粒质量m的乘积，即：Fc=m2R(4-1)其中是旋转角速度(弧度/秒),R是颗粒离旋转中心的距离(cm)，m是质量(克)。2) 重力重力(F )是颗粒质量与重力加速度的乘积用下式表示： gFg=mg(4-2)重力的方向与离心力的方向互相垂直，
3、同离心力相比显得十分小，可以忽略不计。例如：离 开旋转中心12cm的颗粒，在N= 1,000转/分时离心，产生的离心力比重力大134倍。因为：Fc/Fg=m2R/mg = 2R/g = (2nN/60) 2R/980 = (2x3.1416x1000/60)2x 12/980 = 134如在超速离心机中进行离心分离，其离心力更大，重力更可以忽略不计。同时颗粒由重力而 产生的浮力(Fb)也可忽略不计。3) 介质的摩擦阻力介质对颗粒的摩擦阻力(Ff)用Stocke阻力方程表示：Ff=6nnrpdR/dt(4-3)其中n是介质的粘滞系数(厘泊，cP)； rp是颗粒的半径(cm)； dR/dt是颗粒在
4、介质中的移动速 度(cm/s),又称为沉降速度，即单位时间内颗粒沉降的距离。上述方程只适用于球形颗粒，但不 少生物颗粒并非球形，有椭球形、扁球形、棒形或线形等，这使情况更复杂。对于椭球形颗粒的 Stocke阻力方程应改写成为：Ff=6nnrp(dR/dt)f/f0(4-4 )其中f0为球形摩擦系数，f为同球形等体积的扁球形或椭球形的摩擦系数。从f/f0可以得出， 颗粒偏离球形程度越大，f越大，则阻力Ff值也越大。4) 浮力在重力场中，浮力的定义是指被物体所排开周围介质的重量。但在离心场的情况下，颗粒的 浮力与离心力方向相反，为颗粒排开介质的质量与离心加速度之乘积。用下式表示：FB=Pm(m/P
5、p) 2R=Pm/Ppm 2R(4-5)其中Pp为颗粒密度(g/cm3)，Pm为介质密度(g/cm3)，m/Pp为介质的体积，Pm (m/Pp)为颗粒排开介 质的质量。综上所述，在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、浮力FB和摩擦阻力Ff。当离 心转子从静止状态加速旋转时，原来处于悬浮状态的颗粒如果密度大于周围介质的密度，则颗粒 离开轴心方向移动，即发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动， 即发生漂浮。无论沉降或漂浮，离心力的方向与摩擦阻力和浮力方向相反；当离心力增大时，反 向的两个力也增大，到最后离心力与摩擦阻力和浮力平衡，颗粒的沉降(或漂浮速度)达到某一极
6、 限速度，这时颗粒运动的加速度等于零，速度dx/dt变成恒速运动。那么顼(4-6)将式4-1，4-3，4-5代入式4-6得m2R=6nnrpdR/dt+(Pm/Pp)m2R (4-7 )其中球形体积V为4nrp3/3，m=VPp=(4nr3p/3)Pp故4-7式可写成：(4nrp3/3)(Pp)(2R) = 6nnrpdR/dt+(4nr3/3)(Pp)(2R)整理后得：dR/dt=4rp2 (Pp-Pm)/18n2R(4-8)或者：V = dR/dt=d2(Pp -Pm)18n2R(4-9)上式d为颗粒直径(厘米)，对于非球形颗粒还应考虑f/f0的摩擦系数比，得：dR/dt=d2(PpPm)
7、/(18nf/f0)2R(4-10)从式4-10可见：颗粒的沉降速度与颗粒直径的平方、颗粒与介质的密度差和离心加速度 成正比，而与介质的粘滞度、颗粒偏离球形的程度成反比；当颗粒的密度Pp大于介质密度Pm 颗粒发生沉降；当PpVPm时，颗粒漂浮；当Pp=Pm时，颗粒不沉不浮；在离心加速度序R不 变的情况下，颗粒的沉降速度主要决定于颗粒的直径大小和颗粒的形状，而颗粒的密度所起的作 用较小。2、沉降系数1924年，Svedberg定义沉降系数为颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度。即：S=(dR/dt)S2R(4-11)沉降系数的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达极限速度所经过的时间。沉降系
8、数的单位用svedberg表示，量纲为秒，1 svednerg = 10-13秒，简称S。将式4-10二边同除以2R，得到沉降系数的表示式：S = (dR/dt)/2R=d2(PpPm)/(18nf/f0)(4-12)从上式可知：在给定的介质中沉降系数的大小主要是由颗粒直径的平方和摩擦系数f/f0所决 定。3、相对离心力和离心时间1) 相对离心力(RCF):是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数。重力加速度g=980厘米/秒2。故RCF的公式如下：RCF=Fc/Fg=m2R/mg = 2R/g= (2nrpm/60)2R/980= 1.118x10-5R(rpm)2如以N代表
9、rpm，同上式可转化为：RCF =1.118x10-5RN2(4-13)其中R为离心转子的半径距离(cm)，N为转速(转/分)。一般情况下，低速离心时常以rpm来表示，超速离心则以g表示。计算颗粒的相对离心力 时，应注意离心管与旋转中心的距离R。由于转子的形状及设计差异，离心管的口部和底部到旋 转轴中心距离差异很大。如：离心管口 R=4.8厘米，管底R=8.0厘米，rpm=12000RCF 口部=1.118x10-5x(12000)2x4.8=7737xgRCF 底部=1.118x10-5x(12000)2x8.0 = 12891xg由此所见，作用于离心管口部和底部的离心力相差近乎一倍。这不仅
10、说明了超速离心时用g 代替rpm的原因，也说明了 R应指旋转轴中心到某被分离物质颗粒在离心管中所处位置的距离， 该颗粒所受到离心力随其在管中的移动而变化。科技文献中，离心力的数据常指其平均值，即离 心管中点的离心力。为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole和Cotzias在式4-13的基础上制作了三 者关系的列线计算图4-2,图示法较公式法计算方便。已知离心转子的半径、转速和相对离心力 中的任意两个数值，可以求得第三个数值。在列线计算图中找到两数值对应的点位置，过两点作 直线，直线与第三条列线相交，交点的数值即为所求第三者的值。2) 沉降时间(t)：在某一个介质中使一种球形颗粒从液体的
11、弯月面沉降到离心管底部所需要 的离心时间。沉降时间与沉降速度成反比。t= 18n/2d2(PpPm)ln(Rmax/Rmin)(414)Rmax和Rmin分别代表转轴中心至离心管底部和液面的距离。转子半径相对离心力转速图4 2离心机转数与离心力的列线图如果已知某种颗粒的沉降系数(S)，则可估计其沉降时间(t)t=1/S (lnRmax-1nRmin)/2(415)离心时间是由实验要求所决定，为了避免不稳定颗粒的凝聚、挤压损伤或变性失活，并使扩 散所导致的区带加宽现象减弱，在保证分离的前提下，应尽可能缩短离心时间。相反，分离某些 沉降较快的大颗粒时，为了达到预期的分离效果，往往使用粘度较大的梯度
12、，以阻止颗粒的过度 沉降，并延长离心时间。4、离心机的分类目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多，按其离心转子能达到最高转速分类有：低速 离心机(在6,000rpm以下)、高速离心机(在25,000rpm以下)和超速离心机(在30,000rpm以上)。 目前商售大型超高速离心机最高转速达100,000rpm，相对离心力803000Xg。在超速离心机中， 根据用途不同，又可分为制备型超速离心机、分析型超速离心机及制备分析两用型超速离心机。 近年制备型与分析型界限在逐步消失，出现制备分析两用机，通过更换转子和装上光学附件进行 分析工作。用制备型的区带转子或水平转子，运用密度技术可测定颗粒沉降系数
13、、病毒或核酸的 浮力密度，部分代替了分析型超速离心机功能。表41三种不同级别的制备离心机的比较类型普通离心机高速离心机超速离心机最大转速（rpm）6,00025,00030,000以上最大RCF(g)6,00089,000可达510,000以上分离形式差速离心差速离心密度梯度区带分离 或差速沉降分离离心管平衡 允许误差0.25 克0.1克0.1克转子角式和外摆式转子角式，外摆式转子等角式，外摆式，区带转子等仪器结构、性能和特点速度控制不严格， 多数室温下操作有致冷装置，有较准确速度 和温度控制系统有真空和冷却系统，精确的温度 和速度控制、监测系统，保证转 子正常运转的传动和制动装置。应用收集易
14、沉降的大颗 粒（如RBC，酵母细 胞等）收集微生物、细胞碎片、大 细胞、硫酸铵沉淀物和免疫 沉淀物等。但不能有效沉淀 病毒、小细胞器（如核糖体）、 蛋白质等大分子主要分离细胞器，病毒，核酸蛋 白质，多糖等甚至能分开分子量 相近的同位素标记物15DNA 和未标记的DNA二、离心分离的种类根据离心原理，可设计出各种离心方法，归纳起来有二大类（表4-2）。分析型超速离心方法 在这里我们不予讨论。表4-2离心分离法的分类离心方法差速离心速度区带离心密度梯度区带离心等密度离心颗粒沉降系数相差大（1n个数量 级）离心特点短时间、多次采用不 同速度和离心时间 进行分段离心适用范围分子量（或大小）相差 大，不
15、稳定，易变性、 易受梯度介质损伤 的颗粒。常用于从组 织匀浆中分离细胞 器及分离病毒相差较少（2%或更少）。或分 子量相差3倍的蛋白质 沉降速度主要依赖于颗粒 的形状和大小离心时间 较短，颗粒沉降速度不可能 为零，若时间过长，分离开 的区带有可能在管底重新靠 扰颗粒密度不等于周围 介质密度大小不同而密度相似，受差 速离心挤压变形，受低浓度 梯度介质损伤较少的颗粒。一次分离量较少，宜作分析 分离。可分离核酸、蛋白质、 核糖体亚基及其它成份（如整 细胞、脂蛋白）沉降平衡主要依赖于颗 粒的密度离心时间较 长，一般大于15h，平衡时 沉降速度为零，形成稳定的 区带沉降平衡时，颗粒 密度一定等于周围介质的 密度 大小相同而密度不同，稳 定、不受高浓度介质损伤的 颗粒。一次分离样品量大， 用于制备及分析分离。可分 离核酸、亚细胞器、整细胞， 也可分离复合蛋白质，但简 单蛋白质不适用1、差速离心法差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同 离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。进行差速离
