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1、方案一：口服菌苗的制备一、实验器材：1、 嗜水气单胞菌、 营养琼脂平板、营养肉汤培养基、牛肉膏蛋白 胨培养基、lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管， 试管架，恒温培养箱、03甲醛、离心机、生理盐水，2、冰箱、吐温一 80乳化剂（或吐温一 80乳化剂+白油+高压均质机 或膨化饲料及蛋白多糖粘合剂 或轮虫） 二、制备方法：1、菌株培养及灭活：（甲醛灭活）将筛选获得的免疫原性较好的嗜水气单胞菌接种于营养琼脂平板 28C培养24h；挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中，28C培养 24h .收集菌液。取少量菌液按常规方法做细菌计数（即平板菌落计 数法。用0.3%甲醛灭活2d，经检测确无活
2、菌后，000xg离心20min。 菌体重悬于生理盐水中，调整菌液浓度为10CFU/mL。经检测确无 活菌后4C保存备用。其中无菌检验是取少量菌液分别接种琼脂平板 和肉汤中，28C培养72h,若平板无细菌生长，肉汤澄清，即说明甲 醛灭活完全，无菌检验合格。2、疫苗的制备：（口服菌苗） 将已灭活、检验无菌合格、调整好的菌液加入适量的吐温一 80.充分摇匀至其完全溶解后备用。 或在7号白油中加入适量司班一80乳化剂，并按菌液（水相）： 白油（油相）=1： 3配比，混匀后用咼压均质机乳化后分装，将制成的 嗜水气单胞菌油乳剂苗保存于室温或815C冷库中备用。 或按每0. 3mL嗜水气单胞菌灭活菌液与每0
3、. 69膨化饲料及蛋白多 糖粘合剂混合均匀后，阴晾40min左右，用于口服免疫投喂。 细菌经实验室扩大培养后灭活，投喂轮虫制成生物包囊方案二：疫苗制备及条件的确定：（探究验证）一、实验材料：嗜水气单胞菌、2216E培养基、2216E液体培养基、离心机、大烧杯、无菌平皿、无菌试管、不同浓度的福尔马林溶液、 无菌生理盐水二、疫苗制备步骤：（1）嗜水气单胞菌的扩培与稀释：将接种于筛选获得的免疫原性较 好的嗜水气单胞菌2216E斜面，培养28C48h，加入无菌生理盐水 制成菌悬液。再接种于液体 2216E 培养基 ，振荡培养 （转速为 100110r / min ） 48h,菌液浓度为 2.5X109
4、C fu/mlo（2）将上述分离得到的原致病菌接分别加入不同浓度的福尔马林（0.05%, 0.1%, 0.2% ,0.5% , 1.0%） （v/v）并分别置于4C、 28C和60C处理数小时，另外1组用热灭活方式60C处理。每间隔 一定时间，取0.1ml的菌液涂布2216E平板，每组2个平行，置于28C培 养72h,观察平板上是否有菌落生长。按以上确定的最佳灭活条件，将制备的浸泡用疫苗置于4 10C保存。 注射用疫苗在2216E斜面上培养48h后，菌液浓度为2.5 X109cfu /ml，用无菌生理盐水洗下，按以上确定的最佳灭活条件灭活，4C环 境中保存。使用时每尾鱼（体重100g左右）注射0.2m 1。
