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1、一、用固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种微生物纯种分离2将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程纯培养（pureculture）1在适宜条件下培养纯种获得的培养物（群体）培养物(culture)：在微生物学中，把人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物。菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落(colony)。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便称为菌苔(lawn)。大多数微生物能在固体培养基上形成独立的菌落，可采用平板分离得到。一个菌落是一个纯种，也是一
2、个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；在液体培养基中不会形成菌落不同微生物在特定培养基上形成的菌落或菌苔一般都具稳定特征，可成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立菌落，采用适宜的平板分离法很易得到纯培养。所谓（培养）平板，是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基，可使每个孤立活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术
3、简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。（一）、微生物纯种分离的原理和方法不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的话微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植
4、。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。（二）、纯种平板分离的不同方法1、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)待分离材料用无菌水作一系列稀释取不同稀释液少许，与熔化且冷却至50左右的琼脂培养基混合摇匀后，倾入灭过菌培养皿中待琼脂凝固后，制成可能含菌平板，平板倒置在恒箱中培养。保温培养一定时间，可能出现在平板表面的单个菌落，该菌落可能是由一个菌体繁殖形成。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2、涂布平板法（spread pla
5、te method)由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法、微生物悬液适当稀释、稀释液放置在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上、用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上、恒温培养3、平板划线法（streak plate method）用无菌的接种环以无菌操作沾取少许待分离的培养物，在无菌的平板表面上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有扇形划线、连续划线、方格划线、放射划线、四格划线等。当接种环
6、在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。4、稀释摇管法（dilution shake culture method)培养厌氧微生物用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。对厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法。、培养基熔化，冷却并保持在50左右，、待分离的材料用培
7、养基梯度稀释，迅速摇动均匀，、冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，、培养，菌落形成在琼脂柱的中间。挑取和移植单菌落。进行单菌落的挑选和移植，需要先用一只灭菌针将液体石蜡石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。二、用液体培养基分离纯化培养对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。通常采
8、用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的概率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95)表现为不生长。三、单细胞（单孢子）分离单细胞（单孢子）分离法：采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占
9、数量优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、
10、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。四、选择培养分离选择培养分离技术原理：没有一种培养基或一种培养条件能满足自然界中一切微生物生长的要求，在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其他的被抑制。如果某微生物生长需要是已知的，也可设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，即使在混杂的微
11、生物群体中这种微生物可能只占少数。通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊情况外，微生物群落是由多种微生物组成的。因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中微生物数量在108时，必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为102-103，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营
12、养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。1、利用选择培养基进行直接分离：主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，得到纯培养物。有多种方法可以采用。例1、在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰例2、要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某
13、种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可利用其滑动特点进行分离纯化，因滑行能使它们和其他不能移动的微生物分开，可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。2、富集培养法富集培养:人为创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更易从自然界中分离到所需的特定微生物。
14、富集条件可据分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。用途：富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。例：采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程：（1）首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基
15、，并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。2）取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。3）挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为不生长，说明通过该富集程序得到了欲分离的目标微生物。（4）通过富集培养使原本在自然环境中占
16、少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。五、二元培养物分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难做到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。在自然环境中，猎
