《实验一-碱裂解法提取质粒DNA》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一-碱裂解法提取质粒DNA（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测一、实验目的与原理简介实验背景：质粒DNA的提取是基闵工程操作中常用的基本技术。质粒作为 载体应具备下列四个特点： 有足够的容纳冃的基闵的幅度，并且对于携带的冃的基因能够借助载体 的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。 在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易 于基闵片段与载体的连接、重组与筛选。 与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色 表型反应等）。 拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂 解细菌；分离和纯化质粒DNAo实验原理：碱裂
2、解法质粒DNA是基于染色体PNA与质粒DNA的交性与复 性的差异而达到分离冃的的。在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢縫断裂， 双螺旋结构解开而交性。质粒ONA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环 状的两条互补链不会完全分离，调节pH 至中性时，更性的质粒DNA又恢复 到原来的构型，而染色体ONA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体 ONA与不稳定的大分子RNA、罢白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。实验冃的：提取基因工程中运载基闵的载体，掌握晟常用的提取质粒PNA 的方法。二. 实验试剂1, Sol I 100ml： lMTris-HCL （pH8.0） 2.5ml, 0.5M
3、 EDTA 2ml, DOW 91ml, 20% 葡萄# 4.5ml（薊萄糖单独灭，灭完后加入Soli中），高压灭菌，4保存。2, Soin 100ml:（新鲜配制，常温使用）10%SDS50ml, 2M NaOH 50ml 使用 前将两种溶液混合。3, Solffl 500ml: KAc 147g, HAc57.5ml,加 300mlDDW 搅拌，定容至 500ml。 高压灭菌，4保存。4, 70%乙醇 无菌水now5, 苯酚/氯仿/异戊醇（25: 24: 1）氯仿可使罢白变性并有助于液相与有机相 的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡谏。酚和氯仿均有很强的腐蚀性， 操作时应翁手套。三、
4、实验步骤按1/100的比例接种保存的9K质粒大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当 抗生素LE培养基，37C、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种（至对 数生长期）。将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37C、25（）rpm 剧烈震荡培养过夜。1、离心管（10mL）分装菌10ml,离心去上清（lOOOOrpm, 5min, 4C）;弃上清， 将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。2、重悬于8（）（口冰冷的Soli中；剧烈震荡重悬菌体。3、加入1.6mLSoin轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻 底混匀，室温放置lOmin （SolU为
5、裂解液，故离心管中菌液逐渐萸清）。4、加入1.2mL冰冷的Solffl立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置lOmino5、4t, 12000rpm离心10mino Sol III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体 和匪白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K使SDS-页白复合物沉淀。6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，沉淀核酸, 室温放置大于10mino 12000rpm离心5min,小心移出上清于一新离心管中。7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp X 10mino8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1 ml 70%乙醇洗 沉淀一次，12000rmp离心5 min。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。1（）、将沉淀溶于50pl DOW中，储于20C冰箱中。思考题：1、加入酚/氯仿/异戊醇的作用？2、沉淀DNA时为什么用无水乙醇？实验结杲：（请大家详细讨论自己组的实验结果）A组：maker 123456Maker为DL15000,从左到右为组提取质粒结果PPIC9K2 3 3 4 5 MPPIC9KM为DL15000maker,从左到右为1-5组提取质粒结果如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合!
