《常用DNA酶的总结》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常用DNA酶的总结（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1. T4DNA连接酶：本酶催化相邻DNA链的5 -P末端和3 -OH末端以磷酸二酯键结合的反应，（将已有 的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上, 作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键），需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之 间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。无论是T4DNA连 接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。T4?DNA连接酶常用于催化双链DNA 平末端或互
2、补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA?5-磷酸末端和3-羟基末端间的连接。还可以 修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。粘末端的连接反应:？插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致 较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段?DNA浓度及分子大小来计算。平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢（其Km值约为突出末端的100倍）。进 行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的25倍左右。与粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DN
3、A的摩尔比调整为1:1,同时增大DNA浓度以便取得良 好效果。？口g/ul以上）。反应温度：该酶的最适温度为37C，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16C下进行。若反应 1-2小时左右的话也可在室温下进行反应。抑制剂：T4?DNA连接酶要求Mg?2+，因此螯合Mg?2+的EDTA?的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA 缓冲液中的?DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。2. T4 DNA聚合酶：T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以依赖于DNA 模板对5端突出末端进行补平；同时可对3端突出末端进行削平。
4、也可以在结合有引物 的单链DNA模板上，从5T3方向催化DNA合成反应。特点：T4DNAPolymerase由于同时具有5T3 DNA聚合酶活性和3T5 DNA外切酶活性（但不具有 5T3外切酶活性），可以用于将5端突出末端补平、3端突出末端削平。T4DNAPolymerase的3T5外 切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。用途：T4DNAPolymerase可用于催化以下反应：DNA5或3突出末端的平滑化；通过置换反应进行 标记DNA探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆。活性定义：37C 30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸（d
5、NTPs）掺入到多聚核苷酸中所需的酶 量定义为1个活性单位。反应方法：例如，酶切完成后，没有进行任何处理，直接加入一点T4 DNA聚合酶、dNTP和BSA，37C10min失活或抑制：70C加热10分钟可使T4 DNAPolymerase失活。金属离子螯合剂可以抑制T4DNAPolymerase 的活性。般的Klenow Fragment和T4 DNA Polymerase都有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，因此都 可以用于补平和削平。所不同的是，T4 DNA Polymerase的活性更强。3. Klenow Fragment:又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I polymeras
6、e I)的大片断(Large Fragment) 0 Klenow Fragment保留了 DNA聚合酶I的5T3聚合酶活性和3T5外切酶活性，但缺少 完整的Klenow酶的5T3外切酶活性特点：对5突出或3突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。用途：双链DNA 5端突出(5overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA 3端突出(3overhang)的削平 5突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点 突变反应第二链的合成。来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA基因片段。Fermentas 公司
7、的 Klenow Fragment 有 2 种。一种是DNA Polymerase I Large Fragment (Klenow Fragment)， 该酶用于补平的时候不会在补平后再多加碱基。另一种是DNA Polymerase I Large Fragment, Exonuclease MinusKlenow Fragment exo-，此酶没有3-5”外切酶活性，因此不能用于削平；而且，此酶在补平的时 候会在补平后再加一个或更多碱基，所以不太适合用于补平。4. T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK):T4 Polynucleotide Kinase， T4 PNK，该酶能够催化磷酸在g-
8、位和双链/单链DNA或 RNA的5 -羟基末端以及3 -单磷酸核昔间进行转移和交换：5-OH +NTP5 -P+NDP。 该酶还具有3磷酸酶活性，将3 -磷酸基团从寡核昔酸的3磷酸末端、脱氧3 -单磷酸 核音和脱氧3 -二磷酸核昔上水解掉。用途:引物或PCR产物的5末端磷酸化以便进行连接反应。合成DNA接头(Linker)的 5末端磷酸化以便进行连接反应。DNA及RNA 5末端的标记，用作寡核音酸探针。5. DNA聚合酶1:1. 能催化单个脱氧核糖核苷酸连接到DNA链的3端.2. 能沿5端到3端方向外切DNA(切除引物)3. 能沿3端到5端方向外切DNA(纠错,或者说DNA损伤的恢复)6. D
9、NA聚合酶2:1. 发挥作用需要镁离子和铵根离子存在2. 同样能参与DNA聚合酶1参与的反应,但聚合活性低3. 能沿3端到5端方向外切DNA7. DNA聚合酶3:1. 主要负责DNA链的延伸2. 能沿3端到5端方向外切DNA在DNA的复制中，DNA聚合酶3负责合成冈崎片段，而DNA聚合酶1负责将RNA引物按逐个核糖核 苷酸切除并替换成对应的脱氧核糖核苷酸，最后由DNA连接酶把各冈崎片段连接起来，复制完成. 活性（37度时每个酶分子每分钟聚合的核苷酸数）:DNA聚合酶1为600, DNA聚合酶2为30, DNA 聚合酶3为9000。8. DNA水解酶与DNA限制性内切酶的区别概述DNA水解酶：催
10、化DNA水解的一种酶，在DNA水解酶作用下，DNA被水解为一个一个的脱氧 核苷酸。任何能水解DNA的酶的统称，见到二酯键就切。限制性内切酶：能切割DNA分子内部的可识别序列的磷酸二酯键，见到识别序列的两侧的磷 酸二酯键就切。9. DNA聚合酶和DNA连接酶的区别？DNA连接酶：是一种将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶。常用于基因工程，将 目的基因连在载体（一般为质粒）上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键。DNA聚合酶：以已有的核酸序列作为模板，将4种脱氧核苷酸（A、T、G、C）按照模板的碱基 排列顺序，以“碱基互补原则”依次连接，聚合成为一条新的DNA链。相同点都是连接的磷酸二酯键。10. DNA水解酶在哪里有作用，作用是水解DNA双链吗？DNA水解酶的作用位点在于磷酸二酯键；DNA在水解酶的作用下，可以得到四种不同的核苷 酸，即腺嘌吟脱氧核苷酸【A】，鸟嘌吟脱氧核苷酸【G】，胞嘧啶脱氧核苷酸【C】，胸腺 嘧啶脱氧核苷酸【T】。DNA在水解酶破坏了氢键和磷酸二酯键，DNA初步水解可以得到脱氧核苷酸。DNA分子彻底水解的产物是磷酸脱氧核糖和ACGU四种碱基，这就就需要另外一种酶了。
