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1、编号:时间:2021年x月x日书山有路勤为径,学海无涯苦作舟页码:第1页 共1页基因工程实验须知一、每次实验前必须预习实验内容,了解实验的基本原理、操作步骤,禁止不预习就做实验。二、每次实验必须做好实验记录,每次实验完成后,根据记录写出实验报告。三、实验所得结果,如不再供下一次实验用,应交给指导教师,并注明名称、数量、组别、姓名等。四、实验室应经常保持整洁、桌面上不要乱放与本次实验无关的书籍、仪器、药品。火柴头、废纸、废液等应放入废液桶中。倒入水槽中的废液(无污染的)立即放水冲掉。五、爱护仪器、节约药品。仪器损坏后应立即报损,并按规定赔偿。六、试验、药品、公用器具使用后应立即放回原处,注意不要
2、调错试剂瓶塞或滴管,以免污染药品。七、实验室必须安静,不得阅读与本次实验无关的书籍:禁止吸烟及吃食物。八、根据实验记录,及时完成实验报告,不按时交报告者,不予记录实验成绩。九、实验完毕,值日生应将实验室打扫干净,关好水、电、门、窗,离开实验室时,检查一遍,以免发生事故,确保安全。实验一 植物基因组DNA提取目的:了解植物细胞的特点,掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。原理:用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品,提取液中的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能螯合金属离子,以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,而细胞破碎液中的蛋白酶K在37温浴过程中还能降解蛋白质,从而减少了蛋白
3、质对DNA的污染。然后用CTAB处理,在特定的盐浓度下,CTAB使基因组DNA处于溶解状态,而蛋白质仍为沉淀。经细胞破碎液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理,其中酚是高效的蛋白变性剂,可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉,然后用氯仿、异戊醇处理,一方面可达到去蛋白的目的,另一方面还可去除残留的酚。一、 材料植物的根、茎、叶。二、 设备移液管,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。三、 试剂1、 CTAB或Nacl溶液:4.1克NaCl溶解于80ml水,缓慢加入10克CTAB,加水至100ml。2、 其它试剂:氯仿、异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,TE,10
4、%SDS,蛋白酶K(20mg/ml),5mol/LNaCl。四、 操作步骤1、 选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干,用蒸馏水洗两次,然后用超纯水洗一遍,吸干,剪碎称0.5-0.25克。2、 将所取材料放入预冷的研钵(研钵提前要灭菌),研成粉末后置于7ml离心管内(可以换为将样品放置到7ml离心管中800ul后用玻棒捣碎)。3、 加入2.4ml 65预热的CTAB,充分混合后65水浴90min以上,冷却到室温,加入等体积氯仿异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀4离心6000g10min,取上清加入2/3体积的-20预冷的异丙醇轻轻混匀,-20度放置20min,4离心5000g5min,去上清。4、
5、 再沉淀中加入0.6ml的65 CTAB温育30min,待沉淀充分溶解,加入等体积氯仿异戊醇充分混匀,4离心6000g5min,去上清加入2/3体积的-20预冷的异丙醇,轻轻混匀-20放置20min。4离心5000g5min,去上清。5、 用70%乙醇清洗沉淀两次,真空抽干,加入200l TE溶解DNA后置于4备用6、 提示:酚、氯仿、异戊醇的作用: 酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白质失去水合状态而变性。变性蛋白质的密度比水的密度大,经过离心与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开,而酚与氯仿有机
6、溶剂比重大,保留在最下层。 作为表面变性剂的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊。酚的变形作用大,但酚与水能有一定程度的互溶,因而损失了这部分水相中的DNA。氯仿的变形作用不如酚效果好,但氯仿不与水相容,不会带走DNA,所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带去。也可以在第二次抽提时将氯仿与酚混合(1:1)使用。异戊醇能降低分子表面的张力,可以减少抽提过程中的泡沫产生,同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。实验二 基因的PCR扩曾反应(聚合酶链式
7、反应)目的:学习PCR反应的基本原理及相关实验技术原理:聚合酶链式反应(PCR,polymerase chain reaction)实质是体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链以后,DNA聚合酶以单链DNA为模版,并利用反应混合物中的四种dNTP,以与模板互补的寡聚核苷酸链为引物,合成新的DNA互补链。新合成的DNA链的起点,由加入在反应混合物中的一对寡聚核苷酸引物在模板DNA链两端的结合点决定,经过PCR的循环即模板DNA变性为单链、引物与模板退火(杂交)、DNA合成三步骤的反复重复,最后,两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数在理论上可扩增达2n,使特定的DNA区段得到迅速、大
8、量的扩增。经过3035个循环,可将2kb的DNA从1pg扩增到0.5-1g,能够通过琼脂糖凝胶电泳检测出来。转基因植物由于含有目的基因,当用针对目的基因来说为特异的一对寡聚核苷酸链作为引物,对其总DNA作PCR时,可以得到特异性产物(目的基因),而非转基因植物的总DNA不会扩增出特异性产物。一、 材料待扩增的基因样品二、 设备基因扩增仪(PCR仪),台式离心机,电泳仪,紫外监测仪三、 器皿微量移液器,微量离心管(0.5ml),微量吸头(Tip头),电泳槽四、 试剂Taq酶,dNPT,10Taq酶buffer,特异寡聚核苷酸引物(primer),模板DNA,无菌去离子水,无菌矿物质油,琼脂糖,溴
9、酚兰指示剂。五、 方法1、 在0.5ml无菌Eppendorf管中,分别以被检测植物的总DNA、阴性对照、阳性对照DNA为模板,进行PCR扩增反应,并设置两个空白对照:没有DNA和没有引物的。向各管中依次加入下列试剂(总的反应体积为50l):无菌去离子水 3332l1xTaq缓冲液 5ldNTP(各2.5mmol/l) 5l 引物R(20pmol/l) 2.5l引物F(20pmol/l) 2.5l模板DNA 12l(含质粒DNA0.010.1g或含植物总DNA0.050.5g) 将以上各试剂(Taq酶除外)混匀后于94变性10min,取出离心管,快速离心几秒钟,使冷凝于管盖上的液体回到管底部,
10、再加入1lTaqDNA聚合酶(约23U),混匀后吸取少量灭菌的矿物质油覆盖于页面上。使用待加热帽的PCR仪时不必家矿物油。2、设置PCR的循环程序,以下循环参数可作为参考:98预变性2min;94变性3060s;5357退火1min;72延伸12min,循环2535次后,72延伸10min(以保证扩增出来的片段都是全长的),扩增反应完全后,取样品反应液550l,用合适的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的结果并照相。提示:1、防止污染: 由于PCR反应的高灵敏性,所以在操作中要严防环境DNA污染,全部器皿均要求灭菌,最好戴一次性手套进行操作,矿物油要分装,一次用一支。为防止交叉污染,最好所有PCR试剂都事
11、先分装成小份备用。装有PCR试剂的微量离心管打开之前,应先在离心机上作瞬时离心,这样可减少污染机会。一般最后加模板DNA,且加样时忌形成喷雾,所有非即用管都应盖严。只要有可能,就应设置阳性对照(即由少量适当的靶序列参与的PCR)和一个空白对照(不含模板DNA的PCR),以检测PCR反应系统是否正常。2、反应系统组成(1)引物在PCR中的浓度常是1mol/L,这一浓度足以完成30个循环的扩增反应,更高浓度可能导致出现意外的非靶序列的的扩增。如果引物的浓度不足,则PCR的效率极低。(2)Taq DNA聚合酶催化以典型的PCR反应所需酶量约为2U。酶量少,扩增效率低;酶过量,则可能导致非靶序列的扩增
12、。(3)dDNA系在饱和浓度(每种dDNA20molL)下使用。(4)靶序列:含有靶序列的DNA以单链或双链形式加入到PCR混合液中。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA,因此用质粒作反应模板时最好先将其线状化。模板DNA中靶序列的浓度因情况而异,可按已知靶序列量递减(1ng,0.1ng,0.01ng等)的方式设置一组对照反应,以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。3、一般来说,模板的作用量越多,PCR的效率相对也高一些,但有一定的限制,特别是在模板DNA质量不太好,杂质含量比较多时,模板增多反而会影响PCR的结果。4、若PCR产物呈降解片段首先减少模板DNA用量。5、PCR产物非特异性条
13、带较多应首先提高退火温度,其次减少引物的用量。有时可以用首次PCR的产物为模板进行再次PCR以得到专一的特异性条带。实验三 碱法小量制备重组质粒目的:掌握最常用的提取重组质粒的方法。原理:从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法很多。其分离可依据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法,羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、两相法等。其中碱变性法提取效果良好,既经济且收得率较高,提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。碱变性抽取质粒DNA是基于染色体DNA于质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下
14、,染色体的氢键断裂,双螺旋结够解开而变性。质粒DNA的大部分液断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAC高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成的缠连得网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。一、 材料LB培养基上生长的菌落二、 设备振荡培养箱、微量离心管、台式高速离心机、恒温高速离心机、冰箱、微型电泳槽三、 试剂准备1、 溶液:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA(pH8.0)。1M T
15、ris-HCl(pH8.0) 12.5ml,0.5M EDTA(pH8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。高温高压灭菌15min,贮存于4。2、 溶液:0.2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml。使用前临时配置。3、 溶液:醋酸钾(KAc)缓冲液(pH4.8)。5M Kac 300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH2O至500ml、4保存备用。4、TE:10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA (pH8.0)。1M Tris-HCl(pH8.0)1ml,0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。高压湿热灭菌20min,4保存备用。5、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)6、乙醇(无水乙醇、70%乙醇)7、5TBE:Tris碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na22H2O4.65g,加ddH2O至1000ml。