《多肽固相合成相关知识-博士精华之作》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多肽固相合成相关知识-博士精华之作（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 .多肽简介及化学合成多肽原理蛋白质的基本结构单位是氨基酸，由20种氨基酸组成的各种各样的蛋白质。每个氨基酸分子（脯氨酸除外）alpha碳原子上都结合一个-NH2、一个-COOH、一个氢原子，和一个各不相同的-Ro肽键是蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式，是一个alpha-NH2和一个alpha-COOH脱水缩合而成的酰胺键。一个氨基酸的a-竣基与另一个氨基酸的a-氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽（peptide）,由2个氨基酸缩合形成的肽叫二肽，由3个氨基酸缩合形成的肽叫三肽，少于10个氨基酸的肽称为寡肽，由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽，如下图。因此蛋白质的结构就是多肽链结
2、构。每个肽在其一端有一自由氨基，称为氨基端或N-末端，在另一端有一自由竣基，称为竣基端或C-末端。R1R2RnRn+1十十1IH2N1ppN1p-NN-1pN-pOHOOOON保护肽缩合来得到两者长度相加的新肽链。R1R2RnRn+R1R2R2n+1R2n+2H?NIJNI-N-NINI1-|OQXNHI|NjN-*-NJ-pNJ-pOQOOOOOOOO化学合成多肽就是把氨基酸按照一定的氨基酸排列顺序和连接方式连接起来。为了得到具有特定氨基酸顺序的合成多肽，采用逐步缩合的定向合成方法，即先将不需要反应的氨基或竣基用适当的基团保护起来，再进行连接反应，以保证反应的定向进行。对于长肽合成，一般有逐
3、步增长和片段缩合两种方式，前者由起始氨基酸（或肽）开始，每连接一次增长一个氨基酸，后者由C保护肽同XNHR1-NR2-NNRn-NRn+；.Y+OOOO2 .固相合成多肽方法多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（竣基端）向N端（氨基端）合成。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。竣基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoco由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成具体合成由下列几个循环组成：1 .去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(pip
4、eridine)去除氨基的保护基团。2 .激活和交联：下一个氨基酸的竣基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。3 .洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，具保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。A周相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的竣基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在周相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化竣基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合一洗涤一去保护一中和和洗涤一下一轮缩合，最后达到所需要
5、合成的肽链长度。周相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，
6、必需通过可靠的分离手段纯化。3 .树脂的选择及氨基酸的固定将周相合成与其他技术分开来的最主要的特征是周相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一
7、个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、竣基树脂、氨基树脂或酰肌型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择竣基树脂如王氏树脂。氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的竣基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲俊盐或钠盐、钾盐、葩盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；竣基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC或竣基二咪坐，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肌型树脂，却是加入适当
8、的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。4 .氨基、竣基、侧链的保护及脱除要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和竣基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧跋基类型作为a氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用甲氧染基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧染基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc（9-方
9、甲氧染基）作为a氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌噬-CH2CL2或哌噬-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。竣基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护竣基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肌以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苇酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。周相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及竣基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将竣基活化，
10、变成混合酸酊、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酊等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酊法、活化酯法接肽应用最广。裂解及合成肽链的纯化。BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少。5 .实例例如合成H2N-Gly-Gly-Gly-Cys-Ser-Asp-Tyr-Asn-His-His-Trp-Cys-COOH1、树脂的选择及活化处理取二氯树脂1.5g加入到用DCM浸泡过的反应柱中，用DCM15mL浸泡30m
11、in使树脂充分膨胀，以活化待用。2、第一个氨基酸的连接称取Fmoc-Cys（Acm）-OH0.31g（依据为：树脂量X取代度X氨基酸分子量X过量倍数）于DCM中溶解，再加入DIEA0.5mL,混合加入反应容器中，吹N2反应2h,将反应液过滤除去加入MeOH5mL封闭反应1h后用DCM、DMF各洗涤树脂3次。3、脱除氨基保护基加入约15mL20%哌噬的DMF溶液反应5min,滤掉，再加入15mL反应20min后用DCM洗涤树脂3次、DMF洗涤树脂3次。4、肽键的形成称取0.55gFmoc-Trp(boc)-OH,0.35gTBTU以DMF溶解，与0.6mLHOBt（2mol/L）,0.2mLDI
12、EA混合加入盛有树脂的反应容器中，吹N2反应2h后用DCM洗涤树脂3次、DMF洗涤树脂3次。重复上述步骤（脱保护和接肽）,按还未成环前的直链肽的序列由竣基端一氨基端的顺序依次连接氨基酸。5、侧链脱保护及环肽脱离树脂洗涤、脱除最后一个氨基酸的Fmoc保护后用N2将肽-树脂复合物吹干，加入50mL小烧瓶中，按10mL/0.5mL/0.25mL/0.5mL/0.75g的比例加入TFA/苯甲硫醴/琉基乙醇/水/苯酚配成的切割试剂。室温磁力搅拌反应3h后，过滤入冰乙醴中，置冰箱2h,离心收集，沉淀用纯水溶解，再置冰箱冷冻，后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机，冻干至包重即得粗肽。6 .多肽的不稳定性多肽的不
13、稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件（如PH、温度、光照、氧浓度等）对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚，使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选道合适的添加剂。引起多肽不稳定的原因1 .脱酰胺反应在脱酰反应中，Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。2 .氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶
14、液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。3 .水解多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。4 .形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与琉基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。5 .消旋除Gly外，所有氨基酸残基的a碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋应。6 .科肖除伊消除是指氨基酸残基中B碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr等残基都可通过
15、伊消除降解。在碱性PH下易发生,消除，温度和金属离子对其也有影响。7 .变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。7 .提高多肽稳定性的途径(1) 定点突变通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。(2) 化学修饰多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。(3) 添加剂通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween等能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。(4)冻干多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、&消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因
