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1、乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测 YLNB 2.8一、凯氏定氮仪常量检测法1. 原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。2. 试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。2.1 浓硫酸2.2 硫酸钾2.3 硫酸铜2.4 氢氧化钠溶液：400g/L2.5 硼酸溶液：30g/L2.6甲基红溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95的乙醇，将溴甲
2、酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L溴甲酚绿：1g/L甲基红为5：1的比例混合。2.7 硫酸标准溶液：c (H+)=0.10000.005mol/L2.7.1 标准溶液的配制：取3ml浓硫酸加到15ml水中，冷却后洗入1000ml容量瓶中，定容。2.7.2 标准溶液的标定：（见GB/T601-2002）2.7 3硫酸铵：干燥后最低含量99.9%，使用前直接将硫酸铵在1022干燥至少2h，在干燥器中冷却至室温。3. 仪器及器材3.1 凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪3.2 消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1）3.3 接收瓶：300ml三角瓶或烧杯4.
3、方法4.1 样品称取4.1.1 原料奶和纯牛奶样品：称取约5g4.1.2 乳饮料：称取约8g4.1.3 冰淇淋：称取约5g4.1.4 乳粉：称取约0.5g4.2 测量4.2.1 消化4.2.1.1将上述样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g硫酸铜，然后加入15-20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化，消化30分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至9档，继续消化直到消化液透明。4.2.1.2 消化至呈透明的蓝绿色后，继续消化至少1小时。在此过程中消化液必须沸腾。注：决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室用仪器
4、测量一个特定得样品所得到大量数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛奶样品，在透明后用不同的沸腾时间（1-1.5h）测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。4.2.1.3 消化结束后，消化液应是透明的。将消化管连同排气盖从消化器上移走，冷却到室温，冷却的消化液应是液体或在管底有少量的结晶体的液体。注：大量的结晶体可能是消化过程中酸损失的结果，它能导致检测结果偏低。为了减少酸的损失，可降低烟吸出的速度。4.2.1.4 消化液冷却至室温后，移走排气盖，在每个管中慢慢加约20ml水，摇动呈旋涡状使其充分混合，保证分
5、离出的结晶体全部溶解，再冷却到室温。4.2.2 蒸馏把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放到接收瓶底端，编辑蒸馏程序，设定硼酸50ml，氢氧化钠65ml，蒸馏时间35min。注：蒸馏时间是根据接收液的体积达到200ml而得到的。4.2.3 滴定4.2.3.1 用pH为7.00和4.00的缓冲溶液校准电位滴定仪。4.2.3.2 设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终点设为4.60，并开始滴定。4.2.3.3 记录结果。4.3 空白试验按照4.2.14.2.3所写的步骤进行空白试验，在消化管中加入0.85g蔗糖，加入蔗糖的作用是使空白在消化过程中
6、与样品消耗等量的硫酸。4.4 回收试验4.4.1方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查，按照4.1.14.1.3的步骤进行。4.4.2用0.12g硫酸铵加0.85g蔗糖进行测定。回收率应大于99。4.4.3用0.18g色氨酸或0.16g盐酸赖氨酸（5.9）加0.67g蔗糖进行测定。回收率应大于98。4.4.4在以上的两个回收试验中（4.4.2和4.4.3），低结果将说明过程失败和（或）硫酸标准溶液的浓度不准确。应检查凯氏定氮仪或重新标定硫酸标准溶液。5. 结果计算5.1氮含量的计算样品中氮含量（g/100g）=其中：V 测定中消耗盐酸标准容液的体积，ml。V0 空白试验中消耗盐酸标准容液
7、的体积，ml。c (H+) 硫酸标准溶液H+的摩尔浓度，mol/L。m样品质量，g。四舍六入的结果保留到0.01%。5.2蛋白质含量的计算蛋白含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以6.38即可。5.3 回收率的计算用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量21.19即可。6.允许差同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5。二、半微量凯氏定氮法1. 原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质
8、含量。2. 试剂2.1浓硫酸2.2硫酸铜2.3硫酸钾2.4过氧化氢溶液：体积分数为30。2.5硼酸溶液：30g/L。取30g硼酸，溶解在1L水中。2.6甲基红溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L溴甲酚绿：1g/L甲基红为5：1的比例混合。2.7硫酸标准溶液：c(H+)为0.1mol/L。配制与标定同常量凯氏定氮仪测定法。2.8氢氧化钠溶液，质量比为400/1000。称取400g氢氧化钠，用1000mL水溶解，待冷却后移入试剂瓶中。3. 仪器及器材3.1凯氏烧瓶：500ml或250ml。3.2定氮蒸汽蒸馏器。3.3滴定管：25
9、ml。3.4三角烧瓶：250ml。4. 方法4.1 精密称取奶粉样品2g或1020g液体样品（约相当于氮3040mg），将样品放入凯氏烧瓶（3.1）中，加入10g硫酸钾（2.3）和1g硫酸铜（2.2），量取20ml浓硫酸（3.1），徐徐加入凯氏烧瓶中，混合。注：1.加入样品及试剂时，避免粘附在瓶颈上。2.加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338）,增进反应速度。10g硫酸钾将沸点提高到400，但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在513会分解。3.加入硫酸铜的作用：作催化剂，使氧化作用加速。 4.2凯氏烧瓶的瓶口放一小漏斗，用微火加热（小心瓶内泡沫冲出而影响结果），当瓶内发泡停止，稍加
10、大火力。同时，可分数次加入10ml过氧化氢溶液（2.4）（但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入）。当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时继续消化0.51h（如凯氏烧瓶壁粘有炭化粒时，进行摇动或待瓶中的内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至呈透明为止）。然后取下并使之冷却。4.3将澄清的消化液小心移入100ml容量瓶中，以水洗三次凯氏烧瓶，洗涤液并入上述容量瓶中，冷却后稀释至刻度并摇匀。4.4吸取25ml消化液与定氮蒸馏器中，在冷凝器的下端放置一个盛有50ml硼酸溶液（2.5）、3滴甲基红溴甲酚绿混合指示剂（2.6）的250ml锥形瓶，冷凝器下端的玻璃管在液面以下。将25ml氢氧化钠溶
11、液慢慢地加入蒸馏瓶中（溶液应呈强碱性），迅速将塞子塞好，然后通入蒸汽进行蒸馏，蒸至液面达150ml时，提出冷凝管靠在锥形瓶的瓶壁，出液口在200ml刻度线以上，继续蒸馏，蒸至液面达200ml。注：1.蒸馏时可视蒸馏器大小，同时减少消化液和氢氧化钠的体积数，保证溶液应呈强碱性。2.蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接收瓶。火力太弱，蒸馏瓶内压力减低，则接收瓶内液体会倒吸，造成实验失败。4.5用硫酸标准溶液（2.7）滴定至溶液出现酒红色为止，记录所用硫酸标准溶液的体积。同时进行空白试验，并在结果中加以校正。5. 结果计算样品中蛋白质含量（g/100g）=式中：v滴定时消耗硫酸标准溶
12、液的体积，ml；v0空白试验消耗硫酸标准溶液的体积，ml；c(H+)硫酸标准溶液中H+的浓度，mol/l；m样品的质量，g；0.014氮原子的摩尔质量，kg/mol；F氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25。注：空白试验仅不加入样品，操作步骤与样品相同。6. 允许差同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5。 7. 注意事项7.1 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。7.2 样品中脂肪或糖含量较高时，消化过程中易产生大量的泡沫，可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。7.3 有机物完全分解，消化液呈兰色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。7.4 蒸馏装置不能漏气。7.5 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈兰色，不生成氢氧化铜沉淀。此时需要再增加氢氧化钠的用量。7.6 硼酸吸收液的温度不能超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。7.7 混合指示剂临用时混合，它在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。因用硫酸滴定硼酸铵溶液，生成硫酸铵应为强酸弱碱盐，所以溶液呈酸性，指示剂应显红色。7.8蛋白测定中，在催化剂中加入二氧化钛，消化速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。蒸馏时可加入锌粒，其作用相当于沸石，用量如绿豆大即可。
