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19)中华人民共和国国家知识产权局(12 )发明专利说明(10)申请公布号CN106947704B(43)申请公布日2020.07.24(21)申请号 CN201710017237.4(22)申请日 2017.01.11(71)申请人 浙江科技学院地址310023 浙江省杭州市西湖区留和路318号(72)发明人 柳永;刘士旺;鲍文娜(74)专利代理机构 杭州天昊专利代理事务所(特殊普通合伙)代理人 向庆宁(51)Int.CI权利要求说明书 说明书 幅图在灰盖鬼伞中实现高准确率定点基因敲除的方法(57)摘要本发明提供一种在灰盖鬼伞中实现高准确 率定点基因敲除方法，采用聚合酶链式反应或全 基因合成的方法获得目标敲除基因上下游序列 后，将上下游序列按与原基因相反方向连接，并 插入到载体质粒上构建环状克隆载体，对环状克 隆载体进行线性化处理得到线型双链DNA，将线 型双链DNA经由5-3核酸外切酶处理，形成 线型 3突出长粘端双链 DNA 后转化灰盖鬼伞细 胞。本发明借助特殊的外源 DNA 结构类型，在灰
