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1、目 录摘要.Abstract.第一章 绪论1.1 DNA生物传感器的概述 1.1.1 DNA生物传感器的研究原理 1.1.2 DNA生物传感器的分类1.2 DNA电化学生物传感器的概述 1.2.1 DNA电化学生物传感器研究原理 1.2.2 单链DNA在电极表面的固定化方法 1.2.3 电化学交流阻抗技术概述1.3 纳米材料在DNA电化学生物传感器中的作用1.4 本论文的选题背景，研究思路，研究目的和研究内容第二章 基于目标DNA诱导取代金纳米粒子的高灵敏度阻抗谱DNA 杂交传感器研究2.1 引言2.2 实验部分 2.2.1 试剂 2.2.2 仪器 2.2.3 金纳米的制备 2.2.3 电化学
2、阻抗谱DNA生物传感器的制备 2.2.4电化学测量方法2.3 结果与讨论 2.3.1 金纳米的表征 2.3.2 电化学阻抗谱DNA生物传感器的表征 2.3.3 PDNA的密度优化 2.3.4 电化学阻抗谱DNA生物传感器的线性范围和检出限 2.3.5 电化学阻抗谱DNA生物传感器的选择性2.4 结论第三章 基于纳米金表面电荷信号放大的电化学阻抗DNA生物传感 器的研究3.1 引言3.2 实验部分 3.2.1 试剂 3.2.2仪器 3.2.3 金纳米粒子和报告探针（DPDNA-AuNPs）复合物的制备 3.2.4 电化学阻抗谱DNA生物传感器的制备 3.2.5 电化学测量方法3.3 结果与讨论3
3、.3.1 金纳米的表征3.3.2电化学交流阻抗法表征DNA生物传感器3.3.3 信号增强溶液的选择3.3.4电化学DNA生物传感器的分析特性 3.3.4.1电化学阻抗谱DNA生物传感器的线性范围和检出限 3.3.4.2 电化学阻抗谱DNA生物传感器的选择性3.4 结论总结参考文献致谢攻读硕士期间的研究成果第1章 DNA电化学生物传感器的研究进展二十一世纪是生命科学世纪，在生命科学得到了空前的发展同时，就不能不提到被誉为人类生命科学史上最伟大工程的人类基因组计划(human genome project, HGP)。1985年美国科学家率先提出了人类基因组计划(human genome proj
4、ect, HGP)，于1990年正式启动。人类基因组计划被誉为人类生命科学史上最伟大工程。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。2002年2月12日，历时10年耗资20亿美元的人类基因组计划最终完成，并报道了99%的人类基因组序列，在20世纪，“人类基因组计划”与“曼哈顿原子弹计划”和“阿波罗计划”并称为三大科学计划，它将对生命科学和人类健康产生巨大影响。 生命科学是生物的生命过程为研究对象的，其中糖、蛋白质、核酸是涉及生命活动本质的三类重要生物分子，对这些物质进行测定和分析技术的发展，取决于人类的科学活动和技术实践。核酸是
5、所有生命体的遗传信息分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。两类核酸都是由单核苷酸组成的多聚物。核酸分子中的核苷序列组成密码，其功能是贮存和传输遗传信息，指导各类型蛋白质的合成。DNA是遗传信息的载体，许多人类遗传疾病的早期诊断是通过检测已知碱基序列的DNA是否出现变异来实现的，检测与疾病有关的变异对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗具有非常重要的意义 DNA(Deoxyribonucleic acid)，中文译名为脱氧核糖核酸。脱氧核糖、核苷酸和磷酸构成了DNA的基本单元，核苷酸由四种碱基组成：腺嘌呤A（adenine）、鸟嘌呤G（guanine）、胞嘧啶C（cytosine）
6、、胸腺嘧啶T（thymine）。Watson和Crick于1953年提出DNA分子为双螺旋结构1，是由两条平行而方向相反的互补核苷酸组成，是通过链间互补核苷酸中的氢键维持的，其中C与G及A与T可分别形成三根和两根氢键2。这种互补为DNA的测序带来了方便。DNA测序的目的就是测定它们的排列顺序，尽管基因组测序已经基本完成，但是大量物种的基因组序列仍未涉及，如何能进一步加快和简化DNA测序工作依然是一个具有挑战性的课题。 分子杂交技术3是利用分子之间的互补性对靶分子进行鉴别的方法，互补性具有序列特异性或形态特异性，它使两个分子彼此间结合，结合的形式包括RNA-RNA、DNA-DNA、DNA-RNA
7、、和蛋白质-蛋白质（抗体）。其中DNA-DNA是应用最多的一种核酸杂交形式。目前大多数DNA生物传感器都是建立在DNA分子杂交的基础上。随着人类对生命本质、生命过程、和生命体与其生存环境的认识不断深入，研究发展新的分析手段越来越重要。分析生物技术受到了大家的关注，而生物传感器（biosensor）便是其中一个重要的领域，它是一个典型的多学科交叉产物，结合了生命科学、分析化学、物理化学和信息科学及其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。生物传感器的出现，是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求多方面驱动的结果，经过30多年的发展，已经成为一个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创
8、新活力的领域。生物传感器已经发展到活体测定、联机在线测定和多指标测定，检测的对象包括各种常见的生物化学物质，在化工、食品、环保和临床等方面均显示了广泛的应用前景。许多在过去被认为较难进行的科学实验也采用了生物传感器技术而变的容易。1984年，在华盛顿召开的国际生物工程年会上将生物传感器列为当代生物工程的重要领域之一。 1.1 生物传感器概述 生物传感器的构成包括两部分：分子识别元件和换能器。被分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转变成可以定量和处理的电信号，再经检测放大器放大并输出，便可知道待测物的浓度。构成生物传感器的分子
9、识别元件为具有生物活性的材料。根据分子识别元件的不同，将生物传感器分为七大类3，酶传感器（enzyme sensor）、免疫传感器（immunosensor）、组织传感器（tissue sensor）、细胞传感器（organelle sensor）、核酸传感器（DNARNA sensor）、微生物传感器（microbial sensor）、分子印迹传生物传感器（molecular imprinted biosensor）。1.1.1 DNA生物传感器的研究原理DNA生物传感器的基本组成和其它的生物传感器一样，不同的是分子识别元件为DNA，在传感器敏感元件固定一条含有十几到上千个核苷酸的单链DN
10、A(ssDNA)，在一定的条件下(包括一定的pH值，离子强度和适当的温度等)，作为分子识别元件ssDNA与另一条含有与其互补碱基序列的目标DNA发生杂交反应，结合成双链DNA(dsDNA)，从而实现分子识别的目的。换能器的作用是将DNA分子杂交后产生的变化转变成相应的电信号。根据杂交前后电信号的变化，推断出被检测的DNA。1.1.2 DNA生物传感器的分类DNA生物传感器依据换能器转换方式的不同，可分为三大类：压电晶体DNA生物传感器、电化学DNA生物传感器和光学DNA生物传感器。（一）压电晶体DNA生物传感器压电晶体DNA生物传感器包括体声波（BAW）和表面声波(SAW)传感器，体声波式是基
11、于压电效应的石英晶体微天平（QCM），是目前应用最广泛的一种压电晶体DNA生物传感器。Yoshio Okahata等人4用间接固定化方法（生物素一亲合素的固定化方法）和直接固定化方法将探针DNA固定在27MHz的镀金的压电石英晶体的电极上，此时质量增加，频率变小，加入目标DNA后，目标物与探针互补，质量继续增加，频率继续变小，当目标物完全与探针键合后，频率不再改变。这样通过频率的变化，利用压电DNA传感器来对杂交的整个反应过程的进行监测。如图1-1所示。Nilsson等人5也利用此原理实现了对目标DNA的检测。图1-1 QCM方法检测DNA Fig.1-1 detecting the DNA
12、with Surface plasmon resonance（二）电化学DNA生物传感器电化学DNA生物传感器可以分为无需杂交指示剂的电化学DNA生物传感器（直接电化学DNA生物传感器）和基于杂交指示剂的电化学DNA生物传感器,6.如图1-2所示。无需杂交指示剂的电化学DNA生物传感器是指直接由杂交引起的DNA界面的电化学性质的变化，Shim等人7证明了杂交后DNA修饰的导电聚合物的导纳明显改变，提出了一种基于测量阻抗的DNA传感器。基于杂交指示剂的电化学DNA生物传感器是指在DNA形成双链过程中选择适当的电活性物质来检测杂交的过程。Yi Xiao等人89将DNA探针的一端标记衍生的亚甲基蓝（
13、MB），通过检测杂交前后亚甲基蓝电化学信号的变化来表征杂交的过程。繁春海等人10采用三明治法，将捕获探针固定在电极表面，杂交以后的待测的长链DNA与标记有生物素的短链报告探针DNA和捕获探针发生杂交反应，标记有辣根过氧化酶（HRP）的亲和素与报告探针一端的生物素结合，加入H2O2和四甲基联苯胺后催化HRP。通过安培法来检测杂交的过程。如图1-2 所示。 图1-2 基于杂交指示剂的电化学DNA生物传感器 Fig.1-2 Sehematic of Basing on hybrid indicator of electrochemical DNA biosensor （三）光学DNA生物传感器 光学
14、DNA生物传感器采用光学换能器，根据所选光学和检测材料不同可以分为表面等离子体共振（SPR）DNA生物传感器、电致化学发光（ECL）DNA生物传感器、荧光DNA生物传感器等多种类型的光学DNA生物传感器。SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感,当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR谱（共振角的变化vs时间）能够反映与金属膜表面接触体系的化。检测DNA杂交是SPR技术最广泛应用之一11。电致化学发光DNA生物传感器是一种将电化学手段、化学发光方法和生物传感技术相结合的一种装置。将DNA链用Ru(bpy)32+衍生物标记后，用ECL检测，可以对DNA进行准确、灵敏
15、的测定12。荧光DNA生物传感是一种将荧光技术和生物传感技术相结合的一种检测DNA的装置，Rothberg等人13在探针DNA一端标记有荧光染料若丹明，由于单链DNA能够缠绕在金纳米表面，使其荧光淬灭。探针DNA和目标物杂交后形成双链DNA后，双链DNA表面带有大量的负电荷会排斥带负电荷的金纳米，此外双链DNA没有裸露的碱基，所以金纳米不能和已经杂交形成双链的DNA结合14荧光不发生淬灭。利用此原理可以检测目标DNA的存在。1.2 DNA电化学生物传感器的概述 与光学15及压电传感器16相比，电化学传感器因其具有高灵敏度、便携性、操作简单等优点获得了广发关注，目前已有多篇文献论述了DNA电化学生物传感器以及他们的应用171819。1.2.1 D
