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1、第一章 基因工程的基本技术内容概要：电泳技术核酸印迹PCR技术琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要成分是D-半乳糖和3, 6脱水L-半乳糖连接 而成的一种线性多糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结 构；琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大 的孔径,高浓度的琼脂糖形成较小的孔径；琼脂糖凝胶的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶 可以分离不同大小范围的DNA片段。琼脂糖凝胶的制作： 将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,加热煮沸至溶液变为澄清,室温下冷却凝固即成。影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、D
2、NA的构象、电压、电场方向以 及电泳缓冲液的组成。Agarose Concentration in Gel (% w/v)Range of Separation of Linear DNA Molecules (kb)0.30.60.70.91.21.52.05-601-200.8-100.5-70.4-60-2-30.1-2核酸分子带负电荷，电泳时，在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐，（Ethidium Bromide）。它能够插入 DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下
3、, 凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10 ng的DNA。注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套！核酸染色:1 ）先染法2 ）后染法观察与拍照在紫外灯（310nm波长）下观察染色后的凝胶ODNA存在处显示出红色的荧光条带。 紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外 光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。聚丙烯酰胺凝胶电泳1 100bp-1kb大小的DNA分子的分离2 RNA分子的分离3变性条件（加热或者6M脲素）脉冲电场凝胶电泳1可以分离100k b以下的
4、分子；2通过有规律地改变电场相对于凝胶的方向，而周期性地使DNA改变其迁移方向 来实现的；3对于电场方向的每次改变，DNA都必须重新安排它的轴线，然后沿新的方向迁 移；4目前最通用的是：曲线夹均匀电场电泳（CHEF）。核酸印迹目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于：检测特定基因的表达基因定位遗传病的检测组织病理学的研究生物分类方面核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出 现稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以 不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源 性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在:DNA 与 DN
5、ARNA 与 RNA 的二条单链之间进行RNA 与 DNA由于DNA般都以双链形式存在，因此在进行核酸印迹时，应先将双链DNA分子解 聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合 成双链的过程称为退火或复性 用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非 同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交转膜是指将核酸分子固定在膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接 将核酸点到膜上是核酸杂交过程中的主要步骤之一探针的标记探针的标记方法：切口平移随机引物用T4多核苷酸激酶标记DNA 5末端切口平移标记（nick translation
6、）DNase I控制其浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端和5-P末端DNA聚合酶I5-3外切酶活性将DNA 一条链的核苷酸切除，暴露单链DNA5-3DNA聚合功能将标记的dNTP加在3-OH末端结果使一条DNA的切口从左到右沿着DNA平移-切口平移随机引物随机引物：多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段，能与任何DNA模板的多个位点配 对互补。与切口平移法相比，随机引物法的优点：只需要一种酶条件易于控制 探针长度较为均一核酸探针的种类：DNA探针cDNA探针RNA探针 寡核苷酸探针探针的标记：放射性同位素标记非放射性检测系统生物素标记地高辛标记免疫金系统 碱
7、性磷酸酶系统 辣根过氧化物酶系统标记方法的选择：应考虑实验的要求，如：灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在检测单拷贝基因的序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法 在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性 磷酸酶系统或辣根过氧化物酶系统核酸印迹的方法1 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)2 点杂交( Dot blot)3 Southern印迹杂交(Southern blot ) DNA4 Northern 印迹杂交( Northern blot )5 组织原位杂交( Tissue in s
8、itu hybridization )菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌 落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检 测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位点杂交法(Dot blot)点杂交法是将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样 准确方便，市售有多种多管吸印仪(manifolds )，如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio-Rad )和只丫 bri-Dot，它们有许多孔，样
9、品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈 斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的 膜就可以进行杂交Southern印迹杂交(Southern blot)DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术1 Southern blot： DNA DNA2是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及 PCR产物分析等方面有重要价值Souther n印迹杂交基本方法DNA标本限制性内切酶琼脂糖最胶电泳分离Northern 印迹杂交(Northern blot)1这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法
10、2 DNA印迹技术称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣 称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blotNorther n印迹杂交的RNA吸印与Souther n印迹杂交的DNA吸印方法类似，但是使RNA变性(尽管RNA是单链，但是有二级结构需去除)需用甲基氧化汞、乙二 醛或甲醛，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。RNA变性后有利于在转印 过程中与硝酸纤维素膜结合以及保持其单链状态组织原位杂交( Tissue in situ hybridization) 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交
11、(它与菌落的原位杂交不同)原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。 因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位臵，这一点具有重要的生物 学和病理学意义PCR：多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法1 1976年Chie n等分离出热稳定的Taq DNA聚合酶2 1985年 Kary Mullis及同事创立PCR技术3 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进入实用阶段4 1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反
12、应”而获得诺贝尔化学奖PCR 的特点及应用PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许 多领域：1、基因克隆、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序 等2、遗传病的产前诊断3、致病病原体的检测4、癌基因的检测和诊断5、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证6、动、植物检疫7、在转基因动植物中检查植入的外源基因的存在 原理及扩增过程：类似于DNA的变性和复性过程变性阶段 加热使模板DNA在高温下（901-95 ）变性，双链解链退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（35 - 651, 般低于模板Tm值的5左右），与模板DNA互补退火
13、形成部分双链延伸阶段 溶液反应温度升至中温（72）,在Taq酶作用下，以dNTP为料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后 延伸为两条双链PCR反应系统的组成主要包括：引物（终浓度：分别为1 uM）寡核苷酸（终浓度： 200 uM）Taq DNA聚合酶模板DNA （基因组DNA： 1 ug,质粒：1 pg）缓冲液引物设计的原则（G+C） %含量45- 55为宜,太少扩增效果不佳,太多则易出现非特异条带ATCG尽量随机分布，避免连续出现5个以上的嘌呤或者嘧啶核苷酸长度一般16- 25个核苷酸（最低不少于16个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸 最佳长度为2024个核苷酸）有时可在5
14、端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完 成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5端加上额外的3-4个核苷酸， 以确保附加的酶切位点有效（保护碱基）两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱 基也不应大于 2 个碱基，否则易生成 “引物二聚体 ”或“引物二倍体 ” (Primer dimer)。引物的3端碱基应与模板严格配对，以避免因末端碱基不配而导致PCR失败引物内部应避免形成明显的次级结构，尤其是发夹结构(hairpin structures) 两条引物的Tm值要相同，(20个碱基左右的引物)可通过公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 计
15、算，适当增加或减少碱基ATGATCGATCGGCATTAGCCTGGGACTTAACCGGTTATCGATCGATGCCGTAATGCACGTAGGCTTGGCCAAATCGTATCGATGATCGATCGGCATTAGCCTGGGACTTAACCGGTTATCGATCGATGCCGTAATGCACGTAGGCTTGGCCAAATCGTATCGatgatcgatcggcattagcctgggacttaaccggttatcgatcgatgccgtaatgcacgtaggctjggcCAAATCGTATCG上游：5，GGAATTCCAIAIGATGATCGATCGGCATTAG-3，下游：5，CCCAAGCTTCGATACGATTTGGCCA-3,Taq DNA聚合酶的选择EnzymeProofreading(3T J exonuclease)5-3?ExonucleaseHeat Stability (min before 50% ac
