354微生物限度检查标准操作规程

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1、山东步长制药股份有限公司操作规程编号：ZSD-QA-354密级：秘密微生物限度检查标准操作规程版本号：04执行日期：2013.06.01下次修订时间：2018.05.31文件内容：1、目的12、范围13、职责14、内容15、附录186、变更记载和原因187、相关文件和记录19发放范围：质量部 质量控制科修订人审核人审核人批准人部门质量控制科质量控制科质量保证科质量部姓名刘凤荣郝松王爱杰黄桂福签名日期第1页 （共19页）山东步长制药股份有限公司操作规程编号：ZSD-QA-354密级：秘密微生物限度检查标准操作规程版本号：04执行日期：2013.10.01下次修订时间：2018.09.301.目的

2、：建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验人员的操作。2.范围：适用于检品的微生物限度检查。3.职责：质量控制科全体人员。4.内容：4.1概述:微生物限度检查法系指用于判断非规定灭菌制剂及其原料、辅料受 到微生物污染程度的一种检查方法，其检查项目包括细菌数、霉菌 数、酵母菌数及控制菌数的检查。微生物限度检查应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级下的单向 流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止污染， 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、 工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。供试品检查时，

3、如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂应证明其 有效性及对微生物无毒性。除另有规定外，本规程中细菌及控制菌培养温度为3035；霉菌、 酵母菌培养温度为2328。检查结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种 可以最小包装单位报告。人员资质及培训要求 从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的 教育背景。试验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确 认它们可以承担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。 应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必须的设备操作、微生物 检验技术和试验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗。4.2设备、仪器及用具4.

4、2.1设备微生物限度室 结构和要求：微生物限度室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污 染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作 间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲 间的门不应直对。温度应控制在1826，相对湿度4565%。操作间 洁净度不应低于C级，局部净化度为A级，或放置同等级 净化工作台。缓冲间 缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到A级。净化工作 台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。消毒处理 微生物限度室应在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）溶液或其他消毒液擦拭操作

5、台及可能污染的死角。开动 层流净化装置，同时用紫外灯照射30min。设备 隔水式恒温培养箱、SPX-250B生化培养箱、恒温水浴锅、匀 浆仪、电热恒温干燥箱、冰箱、 空调、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽 灭菌器。4.2.2仪器及器皿菌落计数器、显微镜、PH系列比色计、电子天平或药物天平（感量 0.1g）。玻璃器皿 锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。玻璃 器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞 入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量 筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿均于160 干热灭菌2h或高压蒸汽121灭菌30mi

6、n，烘干备用。4.2.3用具大、小橡皮胶头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%75% 乙醇溶液浸泡）。无菌工作服、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌， 备用。接种环、酒精灯、75%酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、灭菌称样 纸、不锈钢药匙、试管架、打火机、记号笔、不锈钢盆。4.3试液4.3.1消毒液：75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液、3%来苏水溶液、5% 碘伏溶液或其他消毒液。4.3.2稀释剂和试液：配制所需稀释剂、试液。 pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、二盐酸 二甲基对苯二胺试液、亚碲酸钠试液、无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶 液、过氧化氢试液、靛基质

7、试液、三氯甲烷、1mol/L盐酸试液。4.4培养基：按照培养基配制标准操作规程配制检验所需培养基。 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培 养基（MUG）、麦康凯琼脂培养基（MacC）、胆盐乳糖培养基、曙红 亚甲蓝琼脂培养基、营养肉汤培养基、乳糖胆盐发酵培养基、四硫 磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂培养基、沙门、志贺菌属琼脂培 养基、三糖铁琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、卵黄 氯化钠琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、PDP琼脂培养基、亚 碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基、含庆大霉素的哥伦比亚 琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、1%聚山梨酯80玉米琼脂培 养基

8、。4.5供试品抽样、保存及检验量4.5.1抽样一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装 单位）的3倍量（以备复试）。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机 械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、 虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。4.5.2保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供 试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的 样品不得作为供试品。4.5.3检验量检验量即一次试验所用的供试品量( g、

9、ml、cm2)。除另有规定外，一般供试品检验量为10g或10 ml；膜剂为100 cm2； 贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检验沙门菌的供 试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10 g或10ml用于阳性对 照试验）。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得 少于4丸，膜剂还不得少于4片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍 量供试品。4.6操作方法4.6.1试验前准备将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、 10ml）、量筒、稀释剂等移至微生物限度检查室内。每次试验所用 物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中

10、出入操作间。编号 后将全部外包装（牛皮纸）去掉。开启微生物限度检查室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作时 间为30min。操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。 再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用75%酒精棉球擦手， 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。操作前先用75%酒精棉球擦手，再用75%酒精棉球擦拭供试品瓶、 盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或手术剪刀将供试 品启封。4.6.2供试液的制备液体供试品 取供试品10ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚 山梨酯80使供试品分散均匀。水溶

11、性液体制剂也可用混合的供试 品原液供作为试液。固体、半固体或粘稠供试品 取供试品10g，加入pH 7.0无菌氯化 钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他方法，混匀，作为1:10 的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴适当加温 使供试品分散均匀。4.6.3供试液的稀释（10倍递增稀释法）取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为： 左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿 在酒精灯火焰正上方操作，以免火焰将供试液中菌细胞杀灭）。加 完稀释剂后，试管塞应立即塞上。另取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭 菌稀释剂的试

12、管中混匀，即为1：100供试液。以此类推，根据供 试品污染程度，可稀释至1：102、1：103、1：104等适宜稀释级（至 少共3级）。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm， 反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然 后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2级稀释管的 内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无 粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。4.6.4注平皿 在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取 各级稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液 时可用1

13、支吸管），每一稀释级注23个平皿（此时，一般为左手 执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢 全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时 作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取释稀 剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另 2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另有YPD琼脂测定酵母菌数时， 则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。4.6.5倾注培养基 将预先配制好的培养基熔化,冷至约45时倾注 上述各个平皿15ml20ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混 匀。注意:混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。4.6

14、.6薄膜过滤法：采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径一般为50mm,滤 器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。操作：取出检查用集菌培养器，检查包装是否完好无损，将培养器 逐一插放在滤液槽座上，将其塑料软管装入集菌仪的蠕动泵的管槽 内，注意定位准确，软管走势顺畅。其进液软管的双芯针头插入供 试液容器的塞上，开启集菌仪，将集菌仪倒置，使药液均匀通过滤 器，待药液滤净后，关闭电源，将双芯针头取下，插至装有适宜冲 洗液容器的塞上，冲洗培养基滤膜（取相当于每张滤膜含1g或1ml 供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每 1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。 用pH7.0无菌氯化钠-