《蛋白质组学常见问题及解答》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组学常见问题及解答（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白质组学常见问题及解答作者：未知 来源：华大中生科技公司点击：129时间：2006-9-12Q：重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D的一向吗？A: 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收， 这样跑完1D和2D胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电 泳漕中进行电泳。Q：为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？A:这是因为BioRad的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶 条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有
2、胶条的电泳槽中 的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防 止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 %满）的矿物油。Q：跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？A:刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电 流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。 当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应 的pH条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH区域移动。Q：跑第一向时，为什么会产生一条蓝
3、色的条带，并逐渐向酸性端移动？A:蓝色条带是缓冲液中痕量的漠酚蓝被聚焦所产生的。漠酚蓝也是pH指示剂，当它移动 到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。漠酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质 大分子聚焦之前。Q：跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？A:当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。Q： 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？A:当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH值区域值，从而变 成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。Q:跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气
4、泡产生？A:等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pl值区域，而成为中心分子。这是 加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。Q:重泡胀缓冲液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？A:硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是 增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶 时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相 互作用，防止它们的聚集。Q：怎样估计2D胶上蛋白质点的
5、分子量和pI值？A:可以用BioRad生产的2D胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。Q：为什么2D胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？A:横的脱尾可能是：1 ）一向等电聚焦不完全；2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。Q：什么成分会影响2D胶的效果？A:核酸，盐，去垢剂等等。Q： 2D胶的上样量应该在什么范围？A:上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检 测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在100微克（银染）到500 微克（考染）之间。Q：我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？A:
6、蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会 有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸 附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀 法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白 没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以TCA法最为普遍使用。使用TCA法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残 留的TCA和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可 以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油
7、，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。酶解篇Q：用Trypsin酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？A:酶解时碳酸氢氨的浓度一般在10 - 50 mM之间。碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性 的水解环境，因为Typsin的活力在pH8 - 9之间最高。最常用的碳酸氢氨浓度有20 mM，40 mM。盐浓度过大时，后续的冻干过程 中会有较多的盐析出；盐浓度过小时，则不能有效的提供碱性pH的水解环境（尤其是在样品的pH值低，而且体积大时）。为了确定酶解体系的pH值，可 以用Q： Trypsin储存液的作用是什么？A: Trypsin在pH8 - 9活力最高，所以为了防止酶的自水解
8、，Trypsin母液要处于一个酸性 的环境里以便长期保存。Trypsin储存液的pH大约是5.3，是用来稀释母液用的。如果所需的酶量较大，可以直接用碳酸氢氨溶液来 稀释母液。如果酶解的样品少，可以用储存液来稀释，这样剩余的酶液可以在-800C保存到下次使用。Q: Roche的酶和Promega的酶，那个更好？A: Roche的酶有自降解，而Promega的酶基本上没有自降解。由于酶的自降解峰可以用来 做很好的内标，所以一定限度的酶自降解对MALDI数据的校准很有帮助。Q：什么情况下需要用Ziptip来处理样品？A:当样品含有大量的盐时，需要用Ziptip来除盐；当样品量很少，但体积比较大时（2
9、0微 升以上）时，需要用Ziptip来浓缩。如果样品中有甘油，SDS，或其他杂质时，Ziptip的使用要格外当心，在这种情况下，Ziptip的填料容易被 杂质堵塞；另外Ziptip使用不当时，样品会有损失。所以当样品比较珍贵（的来不易）时，最好先用其他样品做预 实验，摸顺条件后，再作真正的样品。Q:怎样邮寄我的样品？A:冻干的胶或干粉可以直接邮寄。切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在EP管中（不 加任何缓冲液）；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。液体样品的邮寄方式同湿胶一样。Q：为什么要使用内标？A:用内标做校准可以大大减少MALDI-MS的误差（70ppm），从而提高查库结果和可靠性
10、。好的内标肽段需要有以下的要求：最好有两个肽（两点一 线）；质量不要在大多数的肽段范围内（1200 - 2500 Da）；内标的量要与样品的量成比例；内标对其他肽段离子化的抑止要小。我们实验室使用的 内标是25fmol的和-。不过，一般情况下，使用外标做校准也可以达到比较满意的数据（150ppm）。所以，顾客可以根据自己的需要来选择是否使用内标。Q:我为什么还要提供正负空白胶正对照提供（exact）对照两块胶？A:正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。负对照（空白胶）主要是看样品是 否有污染（比如角蛋白的污染）；正对照（已知胶，比如同一块胶上的标准蛋白）主要是检 测酶解和质谱的效果是否正常。如果客户不能提供正负对照，我们可以使用自己预先准备的 胶条。如果顾客的样品量大（10个2D胶上的点），则顾客必须提供正负对照。Q:对于胶上蛋白质的鉴定，我应该提供多少蛋白质？A: 一般情况下，考染能看得见的点都有机会鉴定出来。分子量在2 5万之间的蛋白质， 鉴定成功率一般比较大。分子量小的蛋白酶切位点少，合适的肽段（1000-3000 Da ）就少，所以鉴定的成功率相对较低。而分子量太大的蛋白质，在同等质量的情 况下，蛋白的摩尔数（pmol）较少；而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低（因为整个蛋白质较大），从而影响鉴定的成 功率。
