酶的纯化和固定化

《酶的纯化和固定化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶的纯化和固定化（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、分离纯化的意义:从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生 命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。 工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀 粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 基因工程的需要酶活力：指酶催化反应的能力1min催化1以mol分子底物转化的酶量为该酶的 一个活力单位（Unit），采用最适条件 酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越 快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。酶的总活力：指样品的全部酶活力总活力=酶活力X总体积（ml） 或=

2、酶活力X总质量（g）总活力=活力单位数/ml酶液X总体积（ml）比活力：指酶纯度指标 指单位蛋白质所含有的酶活力（Unit/mg蛋白）比活力=活力单位数/ mg蛋白（氮）=总活力单位数/总蛋白（氮）mg回收率（百分产量）：提纯后与提纯前酶的总活力之比回收率=每次总活力/第一次总活力X 100% ;提纯倍数：提纯后与提纯前比活力之比 提纯倍数=每次比活力/第一次比活力 基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性;防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等； 要求在低温下操作;加入的化学试剂不使酶变性;操作中加入缓冲溶液.抽提有效成分的影响因子：1. pH值2.溶剂的极性和强度3.水解酶4.温度5.搅拌 6,

3、氧化DTT PVP 7,金属离子 1-3mmol/LEDTA8.抽提液与抽提物的比例 5： 1一、预处理组织种类大多数动、植物组织细胞混悬液细菌、植物细胞细菌、酵母培养细胞细胞破碎：机械法：匀浆、研磨、压榨、超声等；非机械法：渗透、酶溶、冻融、化学等 细胞破碎方法匀浆超声研磨酶溶冻融裂解机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法研磨法匀浆法物理破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层 结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破 碎有机溶剂:甲苯丙酮丁醇氯仿 表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎通过

4、细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用， 使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法外加酶制剂法二、抽提（蛋白质溶解）抽提一通常是指用适当的溶剂和方法，使原料中有效成分分离出来 的过程。理想的抽提溶液应具备下述条件：1,对有效成分的溶解度大2,对杂质不溶解或溶解度很小3, 来源广泛、价格低廉、操作安全酶的提取工作应在获得材料后立即开始，否则应在低温下保存，-20 C-70C为宜。或将生 物组织做成丙酮粉保存。水溶法:大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中,考虑因素：盐浓度、pH（等电点 pI）、温度、辅助因子有机溶剂法:酶与脂质结合得比较牢固，不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中采用不同比例的有

5、机溶剂进行提取，如：乙醇、正丁醇等大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为 主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)或 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5-8.0)缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、 稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。酶溶液的浓缩:沉淀法吸附法超过滤法透析法减压浓缩法冷冻干燥法超滤膜是具有特定的均匀孔径和孔隙的多孔薄膜。原理：在加压条件下，把酶溶液通过一层只允许水分子和小分

6、子物质选择性透过的微孔超滤 膜，而酶等大分子则被截留，从而达到浓缩酶液的目的。冷冻干燥法:冷冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩， 有效成分几乎不会破坏。酶的纯化目的：把粗抽提酶液采用科学方法制备成纯度高的酶制品酶的纯化方法：1,溶解度的差异:盐析法,PEG沉淀法，有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法2, 热稳定性的差异:热处理沉淀法3电荷性质的差异:离子交换层析法，电泳法4分子大小和形状的差异:凝胶过滤法,超滤法，透析法,离心法5亲和力的差异:亲和层析法6 疏水作用的差异:疏水层析法7分配系数的差异:双水相系统萃取法 盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的升高而上升。

7、盐析：当盐浓度增高到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部 分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋 白质分子表面的水化层。盐析是可逆的。应用：可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。盐析一般操作步骤：1.选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态，有效成分呈 “盐溶”溶解状态。2.离心分离后得到上清液3.再选择一定浓度范围的盐溶液，使有效成分 等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态。4.用离心法收集沉淀物-即为初步纯化 的有效成分物质。分段盐析不同

8、的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其 水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不 同的蛋白质分别沉淀。二、等电点沉淀等电点(pI):使某一蛋白质所带正负电荷相等时的溶液pH值称为该蛋白 质的等电点。各蛋白质的一级结构不同，pl不同，荷电种类和数量也不同，故可通过电泳 方法分离混合蛋白质。pHpI,蛋白质带负电，体内蛋白质的pl大多为5左右，故生理条件下一般以负离子形式存 在；蛋白质的等电点沉淀、离子交换和电泳均以蛋白质的两性解离和其等电点特性为基础。 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶

9、液pH 值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而 与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。此法很少单独使用，可与盐析法结合用。三、有机溶剂沉淀法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶 解度显著降低。有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有两个1.与盐溶液一样具有脱水作用2. 有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小.注意：1.低温操作2.中性盐的作用3.多价阳离子的作用有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品级酶。 而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于

10、离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是，容易使酶变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。四、凝胶层析（排阻层析）1.概念：凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离 的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为凝胶层析介质。凝胶层析介质主要以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。2. 凝胶层析的原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝 胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢， 最后被洗脱出来。3. 凝胶层析的特

11、点及应用：特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性 等优点。用途：蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质 分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。4. 凝胶的条件亲水性高，表面惰性，稳定性强，具有一定的孔径分布范围，机械强度高.5. 凝胶的类型:葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯胺凝胶，烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺价 交联制成的凝胶（属硬凝胶），琼脂糖与葡聚糖共价组成的复合凝胶（Superdex，复合凝胶）6. 凝胶的选择：混合物的分离程度主要聚决于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物分子量的 分布范围。分子量较小的生物高分子，一般采用交联

12、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶:大分子物质，多用琼脂 糖;处在中间范围的分子，几种都可7. 凝胶用量的计算干凝胶用量（克）=柱床体积（ml）/凝胶的床体积（ml/g）8. 凝胶的处理（1）室温浸泡法（2）加热煮沸法9. 凝胶柱的处理1.柱的选择理想的直径与长度之比是：1： 25-1： 100 2.装柱10. 凝胶柱的鉴定2mg/ml的兰色葡聚糖2000、红色葡聚糖、细胞色素c或血红蛋白等过柱。11. 层析柱的重要参数柱体积：凝胶柱所能容纳的总体积。外水体积：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基

13、质体积：是指凝胶颗粒实际骨架体积。12. 柱层析操作过程层析介质的平衡、膨润；装柱；加样；扩展以及流出液成分的检测和分部收集；柱的再生13. 加样与洗脱加样:加样量与测定方法和层析柱大小有关。加样量的确定要视被分离物在层析柱的分配系K）或洗脱体积（Ve）来决定。洗脱（1）洗脱液，原则：能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活。一般以单一缓冲液或盐溶 液作洗脱液，也可用蒸馏水。（2）流速，严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒 定，理想的分配系数就难以测出。（恒流泵）14. 凝胶柱的再生及保存（1）用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲液进行平衡，即可重复使用；（2）把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处

14、理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。 短时间保存（湿态保存）：反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适当的防腐剂（0.02%NaN3）。 长时间保存（干燥保存）：将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水（70%-90%-95%乙醇）和干 燥（乙醚或60-80度烘干）。Sepharose应以湿态保存五、亲和层析亲和层析法：欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质L（配体）以次级键结合，能生成一 种可解离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S 复合物。根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析法。1. 具有专一性亲和力的生物分子对：酶一底物，特异性抗原一抗体，激素

15、一受体,DNA互补 的DNA或RNA,凝集素和糖蛋白，2. 基本过程：固相化，配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专 一性物质。基质（载体）Matrix :亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。3. 基质的选择理想的基质应满足下面的要求；（1）极低的非特异吸附性（2）高度的亲水性（3）较好的理化稳定性（4）具有大量的化学基团（5）具有适当的多孔性（即孔径大小和筛孔多少）基质种类:琼脂糖，交联琼脂糖应用最多Sepharose 4B,聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺一琼脂 糖凝胶（ACA），纤维素，多孔玻璃珠4. 配体（基）（ligand）的选择与纯化的物质有较强亲和力，具有与基质共价结合的基团，配基和生物大分子结合后，在一定条件下能解离，而且不能破坏生物大分子的生物活性。5. 亲和吸附剂的制备制备：配体偶联到基质上方法： 物理法： 包埋法、吸附法 化学法： 偶联法、交联法漠化氰偶联法：活化、偶联、除去未结合的配体、配体结合量的测定6. 提高吸附剂的操作容量在配体和基质之间引入手臂”，增加配体的取代程度,配体与基质以最少的键连接，基质多孔 性的影响，其他（样品浓度、PH值、离子强度、上样速度）7. 洗脱目的：使固定化配基和生物高分间的亲和力降低，解开生物高