《考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架》由会员分享，可在线阅读，更多相关《考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架一、 实验目的a) 掌握细胞骨架的特点及在细胞中的基本位置。b) 掌握考马斯亮蓝染色法观察细胞骨架。c) 了解各种试剂在细胞骨架染色观察中的作用。二、 实验原理细胞骨架(cytoskeleton)是细胞内以蛋白纤维为主要成分的网络结构。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质， 狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管(microtubule,MT)、微丝(microfilame nt,MF) 和中间纤维(int ermedia ted filame nt,IF)。微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约2026nm的长度不一的小管。分 布在核周围
2、，呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为 膜泡运输的导管。微管蛋白有a和B两种。a B异二聚体沿纵向聚合成 丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管不稳定，对低温(冷冻)、高压等 物理因素及秋水仙素(微管断裂剂)等化学因素敏感。紫杉醇可以和微管蛋 白多聚体结合，抑制微管解聚。微丝在真核细胞内主要由肌动蛋白(actin)组成的直径为57nm的骨 架纤丝。主要分布在细胞质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞 运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白分为a、B和Y二种类型， 不同种类细胞中肌动蛋白组成不同。肌动蛋白单体为球形，依次连接成链， 两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝
3、。细胞松弛素B为微丝断裂剂。中间纤维是直径介于微丝和微管之间(7llnm)、由多种不同蛋白组成 的细胞骨架成分。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质 膜，与质膜骨架相连结。主要起机械支撑和加固作用。中间纤维在不同细胞 中的蛋白组成不同，可用于鉴定肿瘤细胞来源。 细胞骨架在细胞形态维持、细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细 胞分裂等一系列方面均有重要作用，所以对于细胞骨架的研究是近代细胞生 物学最活跃的研究领域之一。由于细胞骨架易受各种理化因素的影响而发生 形态变化，细胞骨架也常作为目标研究环境温度、放射线、重金属、致癌剂 及抗癌药物等对细胞的影响。显示细胞骨架的常用方法有两
4、种：考马斯亮蓝染色法和免疫荧光染色法。考 马斯亮蓝染色法具有简单易行的特点，但不能区分骨架蛋白的组成，仅能用 于骨架形态及完整性研究；免疫荧光染色法可特异显示骨架蛋白，具有更普 遍的应用意义。用去垢剂Triton-X-100处理细胞，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白 疏水区结合而将其溶解掉，剩下细胞骨架系统的蛋白不被溶解掉，然后用蛋 白染料考马斯亮蓝染色即可显示骨架结构。二、 实验仪器及试剂a) 实验材料洋葱鳞茎内表皮b）实验试剂i. M缓冲液，配方：1. 咪唑 50mmol/L, 2.KC1 50mmol/L, 3.MgCl2 0.5mmol/L, 4.EGTA lmmol/L, 5.ED
5、TA 0.1 mmol/L，6.巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） lmmol/L。（用 1 mol/L 盐酸调 pH 至 7.2。）ii. 6mmol/L（pH6.8）磷酸缓冲液，用 NaHCO3 调其 pH。iii. 1%Triton X-100：用 M 缓冲液配。iv. 0.2%的考马斯亮蓝R250染液。其溶剂为：1. 乙醇 46.5ml2. 冰醋酸7ml3. 蒸馏水46.5mlc）实验仪器显微镜、1.5 ml eppendorf管、刀片等。四、实验步骤a）撕取洋葱鳞茎内表皮若干片，大小约0.5cm*0.5cm,放入盛有1ml PBS（Ph6.8）的eppendorf管中，静置2-3min，
6、使PBS完全浸透。b）吸去缓冲液，用1ml1%Triton X-100处理标本20min。c）吸去Tri ton X-100，用M缓冲液漂洗标本3次，每次静置5min。d）加固定液固定30min。e）用PBS洗涤3次，每次静置5min。f）弃PBS，滤纸吸除残留液体。g）用0.2%的考马斯亮蓝R250染色10min。h）用蒸馏水洗数次，降低背景。i）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。（另外，需要做两个对照组，一个b）、c）不做；另外一个c）不做。对比 三个的差别。）五、实验结果a）不做b）、c）两步的观察结果如上图所示，在不用去垢剂的情况下，细胞中的蛋白质都会被考马斯亮蓝染上色
7、。箭头1所指的为细胞壁，其被考马斯亮蓝染上明显的蓝色，故其上有大量蛋白。箭头 2 所指的，为细胞质当中被染成蓝色的泡状物 质，为细胞质中大量的蛋白质。箭头 3 所指的为被染色的细胞核。b）不做c）的观察结果如上图所示，因为用了去垢剂处理，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解掉，剩下细胞骨架系统的蛋白不被溶解掉。所以箭头 1 所示的细胞膜处的蛋白质及糖蛋白等已被溶解故考马斯亮蓝在1处无法染色，与a）中图相比细胞膜处的蓝色消失。但又没有用M缓冲液进行漂洗，所以如箭头 2 所示，细胞质当中基本被已经溶解的可溶 性蛋白质小泡充满。c） 所有步骤都做的观察结果如上图所示，在用去垢剂溶解
8、可溶性蛋白质，并用M缓冲液漂洗以后， 可溶性蛋白质被除去，即与b）图中相比，细胞质中的颜色明显淡了很多。细胞中被考马斯亮蓝染色的即为细胞骨架：微管、微丝、中间纤维。六、思考题a）比较用与不用l%TritonX-100处理的实验结果。不用1%TritonX-100处理的细胞内的蛋白质都能被考马斯亮蓝染上色。 而用1%TritonX-100处理的细胞，细胞当中的可溶性蛋白都被 1%TritonX-100溶解掉，细胞膜上的蛋白质和糖蛋白都溶解掉，细胞当 中能被考马斯亮蓝染上色的只剩下细胞骨架。b）查阅资料说明M-缓冲液中咪唑、MgCL2、EGTA、EDTA、巯基乙醇或二硫苏 糖醇（DTT）在稳定细胞
9、骨架中的作用。i. 咪唑：稳定PH值，缓冲作用。ii. KCL：提供离子，对骨架起聚合作用。iii. MgCL2:提供离子，对骨架起聚合作用。iv. EGTA:螯合Ca离子Ca离子对聚合不利。v. EDTA:螯合Ca离子Ca离子对聚合不利。vi. 巯基乙醇：起还原作用，稳定骨架结构。c）设计检测微丝的间接免疫荧光法实验流程。i. 撕取洋葱鳞茎内表皮，放入eppendorf管中。ii. 用10%中性福尔马林固定20min。iii. 用PBS洗3次，每次5min。iv. 室温下浸于0.5%TritonX-100内作用20min。v. 用预温至37C的PBS洗3次，每次5min。vi. 加FITC标记的抗微丝蛋白抗体反应：向细胞标本滴加约50 L稀释好的标记抗体溶液，放于人工湿盒内，37C避光反应45min。vii. 用PBS洗3次，每次5min。viii. 将洋葱鳞茎内表皮从eppendorf管中取出，在载玻片上展平。ix. 封片置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。微丝呈现绿色。d）注意事项a）防止洋葱鳞茎内表皮卷曲、折叠。b）TritonX-100处理时间应足够，处理完洗涤应充分，否则胞内会存在 膜泡状结构及其它杂蛋白，干扰骨架染色及观察。c）Tri to nX-100处理后各步操作应轻柔，避免容器剧烈震荡及吸管吹打 过猛引起骨架蛋白束断裂。
