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1、靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性一、实验原理靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生 成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+N含量呈正比，线性范围为0.050.5mg/l之间。靛酚蓝反应原理如下:NH3 + OClNH2C1 +OH-。一/ % + NH.CI + 0H-*- Cl +3H.0|=/1FefCNJjONO* X=Z0 N - CL + 0一N4一0 + HC10=：OH + Cl三、实验试剂1）10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。2）柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）： 184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸
2、馏水。将两溶 液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）： 62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫 升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将 AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（9ml100ml中）5）氮的标准溶液（0.1mg/ml）:精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得 到1ml含有0.1mg氮的标准液。6）甲苯四、实验过程1
3、. 标准曲线的测定吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。从其中分别吸取0, 1.00, 3.00, 5.00, 7.00, 10.00ml 13.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。 紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟，用水稀释至刻度。将显色液在可见分光 光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为 横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。2. 土样中脲酶活性的测定分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部 湿润为宜。放置15分钟后，加
4、入10ml 10%尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇 匀。将锥形瓶放入37C恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38C水稀释至刻度，充分 摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中 所做的空白对照。分别吸取（1-3ml）滤液于50ml容量瓶中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml 苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈 现靛酚的蓝色（在1h内保持稳定）。在分光光度计上用1cm比色杯，于578nm处进行比色测定。无土对照：不加土样，其他与实验同，以检
5、验试剂忖度，整个实验设1个无基质对照：以等提及水代替基质，其他与实验相同。土壤脲酶活性以24小时1g 土壤中NH3-N的毫克数表示。注意事项：1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排 除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分 解。3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算：以24小时后1g 土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。Ure= （a样品一a无土一a无基质）XVXn/m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数；V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；m表示烘干土重
