《具核梭杆菌对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌致病作用的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《具核梭杆菌对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌致病作用的影响（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、具核梭杆菌对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌致病作用的影响背景和目的牙周炎是多种细菌混合感染所致的口腔炎症性病变, 可以导致牙周支持组织的破坏和牙齿的松动脱落。以往的研究表明, 牙周组织的细菌性感染是由口腔菌群和其周围的上皮细胞相互作用的结果。因此 , 研究不同种类的牙周致病菌及其宿主细胞之间的互动影响是非常必要的。到目前为止 , 在龈下菌斑生物膜中发现至少有300 多种不同种类的细菌。龈下细菌的聚集有一定规律, 按照它们的聚集特点以及与牙周状况的关系,分为 6 个主要的微生物复合体。与牙周炎关系紧密的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)和伴放线聚集杆菌 (A
2、ggregatibacteractinomycetemcomitans,Aa)分别为红色复合体和绿色复合体。然而 , 他们经常在橙色复合体存在的环境中被发现, 比如有具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)的微生态系。 Fn 是一种有致病潜力的口腔共生菌 , 其独特之处是能够与几乎所有的口腔细菌发生共聚 , 可以作为共聚桥连接早期定植的细菌和晚期定植的细菌。因其具有广泛的共聚能力被认为在牙菌斑成熟过程中发挥重要作用 , 在牙周病变的进展过程中起到了间接的促进作用。 此外 , 有研究表明 Fn 能够与 Pg 和 Aa相互影响。与其他感染性疾病相似 , 致病菌对上皮细胞表
3、面的粘附和随即发生的入侵过程是牙周炎发病的关键阶段。数十年以来, 致病菌的入侵能力一直被认为是牙周炎的潜在致病因子。由于不同菌种之间的相互作用,Pg 、Aa 与 Fn 的相互共聚、同时感染可能会影响它们对牙龈上皮细胞的粘附和入侵。细菌与其周围上皮细胞间的相互作用是细菌感染过程中的重要阶段, 牙龈上皮细胞既是物理性屏障, 同时还传递细菌信号 , 是检测细菌存在的传感器 , 维持健康和疾病之间的平衡。在先天性免疫防御机制中 , 细菌与上皮细胞之间的相互作用可以刺激上皮细胞表达多种免疫反应介质。其中, 白细胞介素 -8(Interleukin-8,IL-8)是一种强有效的致炎因子 , 能够促进中性粒
4、细胞的趋化、 激活中性粒细胞并且诱导其增殖。而 - 防御素族的人 - 防御素 2(human -defensin 2,hBD-2)不仅可以吸引单核细胞、促进中性粒细胞的趋化, 也能够激活先天性和获得性免疫防御。在先天性免疫应答中 , 橙色复合体中的细菌和红色复合体中的细菌所产生的功效是不同的 , 分别归属于两种不同复合体的细菌间的相互影响可能会调节IL-8 和hBD-2 的表达 , 从而在牙龈组织的免疫调节方面产生协同效应。因此 , 本研究的目的在于观察Fn 与主要的牙周致病菌Pg、Aa 的相互共聚、同时感染对 Pg、 Aa 粘附和入侵牙龈上皮细胞能力的影响, 以及对牙龈上皮细胞IL-8 的生
5、成和 hBD-2表达的影响。 Pg、Aa 单独粘附和入侵牙龈上皮细胞, 以及Pg、Aa 与 Fn 相互共聚、同时感染时粘附和入侵牙龈上皮细胞的能力均被检测。此外 ,Pg 、Aa 单独或与 Fn 相互共聚、同时感染牙龈上皮细胞时, 利用酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)和实时荧光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR) 分别测定牙龈上皮细胞IL-8 和 hBD-2 的表达。方法 1、Pg、Aa 单独或与 Fn 相互共聚、同时感染时粘附和入侵 Ca9-22 细胞能力的研究牙龈上皮细胞接种于 12 孔平底细胞培养板
6、, 细胞密度为 2.0 105孔 , 每孔lml 。在致感染之前 , 细胞用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline,PBS, pH7.4) 洗两遍 , 用无抗生素的最小必需培养基(minimalessentialmedium,MEM)培养 2 小时。三种不同的菌种接种于脑心浸液肉汤(Sigma, USA)上, 补充 0.5%的酵母提取物 , 氯化血红素 (5 g/ml) 和维生素 K1(5 g/ml), 细菌培养 2 天直到OD660nm达到 1-0 。经 PBS洗过之后 , 菌细胞悬浮于 MEM。细菌悬液 (2.0 107/ 孔) 加入铺满的单层 Ca9-22
7、 细胞中 , 在 37、 5%CO2的孵育箱内培养。在粘附部分的检测中 , 细菌与单层 Ca9-22 细胞孵育 1 小时 , 然后单层细胞用PBS洗四遍 , 去除未粘附的细菌。接下来每孔加入1ml 的无菌蒸馏水用于裂解细胞达 90 分钟 , 将溶解产物稀释1000 倍 , 接种于脑心浸液血琼脂平板(BrainHeartInfusion agar-Supplemented,BHI-S),每板 100 1 菌液 , 在 37厌氧环境中培养10天。在入侵部分的检测中 , 细菌与单层 Ca9-22 细胞孵育 4 小时。在接下来的孵育过程中 , 单层细胞用 PBS洗四遍 , 去除未粘附的细菌 , 接种于
8、含 200 g/ml 甲硝唑和 300g/ml 的庆大霉素的 MEM中培养 1 小时 , 杀灭粘附于细胞外面的细菌。暴露于抗生素之后 , 单层细胞经 PBS洗两遍 , 用每孔 1ml 的无菌蒸馏水裂解细胞 90 分钟。将溶解产物稀释 100 倍 , 接种于 BHI-S 血琼脂平板 , 每板 100l 菌液 ,在 37厌氧环境中培养 10 天。粘附和入侵的微生物所形成的菌落形成单位按照接下来的孵育状况进行计算 , 细菌粘附和入侵的能力用细胞溶菌作用后重新获得的细菌相对于起初加入的细菌总量的百分率表示。 2、Pg、Aa 单独或与 Fn 相互共聚、同时感染 Ca9-22 细胞时 IL-8 和 hBD
9、-2表达的研究为了检测 Ca9-22 细胞所分泌的 IL-8 的总量 , 细菌悬液 (2.0 107/ 孔) 加入铺满 Ca9-22 的单层细胞中 37、 5%CO2孵育 4 小时。然后收集细胞培养液上清,-20 保存。 ELISA 定量分析细胞培养液上清中IL-8 的浓度 , 用鼠 IL-8 单克隆抗体 (1:100, Dako)作为捕获抗体包被微孔板。重组 IL-8 或在测试样品中捕获的鼠抗体通过加入的兔IL-8 多克隆抗体进行检测 , 随即加入生物素化的羊抗兔IgG (1:200, Dako)和链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)以及
10、 HRP底物 2,2 - 联氮基双。 37孵育45 分钟 , 测试样品中 IL-8 的浓度通过已知浓度的重组溶血性链球菌(beta-hemolytic streptococcal, BHS)和 IL-8 所生成的标准曲线测得。从 Ca9-22 细胞提取的总 RNA(2微克 ) 进行逆转录 , 使用 (dT)18 和Superscript酶 (Invitrogen),反应混合物 25 微升 ,42 反应 1 小时。在 20 微升体系中进行实时PCR,反应混合物含有1 微升模板 cDNA、SYBRPremix Ex Taq、ROX Reference Dye (Sigma, USA) 和每一种引物
11、 (0.2 微摩尔 ) 。使用的引物序列是： GAPDH正向引物 ,5 -CAGCCTCAAGATCATCAGCA和-反3向引物 5 -CCATCCACAGTCTTCTGGGT;hBD-3-2 正向引物 5-AGACTCAGCTCCTGGTCAAGCTC和反-向3引物 5-TGGCTCCACTCTTAAGGCAGGTA。-3为了防止扩增出污染的基因组DNA,所有的引物被设计可以扩增至少两个外显子。扩增在荧光热循环仪 (StepOne Plus) 中按照以下条件进行： 94预变性 1分钟 , 然后是 95变性 15 秒、 62退火 15 秒和 72延伸 33 秒, 共 40 个循环。通过熔解曲线
12、分析和3%琼脂糖凝胶检验来验证PCR产物的特异性。在目的基因扩增的同时也扩增管家基因甘油醛-3- 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),使用 2- CT计算相比GAPDH的相对拷贝数。结果1、Pg, Aa 单独或与 Fn 相互共聚、同时感染时粘附和入侵 Ca9-22 细胞能力的研究 Pg、Aa和 Fn 单独粘附细胞的能力分别是0.97 0.38%,2.62 0.58%和 1.06 0.30%。Pg 与 Fn 相互共聚、同时感染时 ,Pg 粘附 Ca9-22 的能力被明显增强至两倍(P<0.05)。Aa粘附 Ca9-22
13、 细胞的能力在 Fn 存在的状态下比A2 处理组约升高 178.24%(P<0.05) 。这些结果显示与 Fn 共同孵育后的 Pg、Aa 粘附 Ca9-22 细胞的能力被增强 ,然而这样的效果可以被Fn 的粘附、入侵抑制剂半乳糖所抑制。Pg、Aa 和 Fn 单独入侵细胞的能力分别是0.35 0.08%,1.01 0.15%和 0.44 0.11%。Pg、Aa 入侵 Ca9-22 细胞的能力在 Fn 存在的状态下比缺乏Fn 时分别显著增强 251.43%和 207.92%(P<0.05) 。这些结果表明 Fn 能够有效增强 Pg、Aa 入侵Ca9-22 细胞的能力 , 然而这样的效果可以被半乳糖所抑制。2、Pg、 Aa单独或与 Fn 相互共聚、同时感染Ca9-22 细胞时 IL-8 和 hBD-2表达的研究在单种细菌感染的实验中,A3 处理组中 Ca9-22 细胞的 IL-8 产生量最高 (428.75 pg/ml),相反的 ,IL-8产生量最低的为 A1 处理组 (386.66 pg/ml)。在多种细菌感染的实验中 , 与 A3处理组相比 ,B1 和 B2处理组中 IL-8 的产生量分别降低 6.12%和 8.05%。而在 C1-C4 处理组中 ,IL-8的产生量均比B1-B4 处理组轻度升高(P<0.05)。在单种细菌感染的实验中,A3 处理组中 Ca9-22
