蛋白质纯化实验

《蛋白质纯化实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质纯化实验（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、蛋白质纯化实验 实验技术简介：双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电 泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离)，然后再进行 SDS-PAGE (按照分子大小)，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。【晶 莱生物】 实验操作流程：1、样本制备2、固相预制胶条水化3、第一向等电聚焦(IEF)4、胶条平衡5、第二向SDS-PAGE电泳6、凝胶染色检测7、图片扫描 实验注意事项：客户提供：1、原样(组织、细胞、菌体等)湿重不少于200mg。2、蛋白提取物，浓度不少于4ug/ul，总量不少于5mg。3、寄样须知：样品需低温保存，

2、用干冰保存快递 。交付标准：1、双向电泳电子图片及定量分析结果，包括差异点号码、差异倍数。2、差异点的一级质谱或二级质谱峰图，质谱鉴定结果，包括pI和MW等。3、双向电泳完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。一、仪器设备色析管柱(Pharmacia C column, 1.6X100 cm)、铁架、铁夹及水平仪；部分 收集器(fractioncollector,需准备干净试管约100支)；浓缩用离心机(低 速5,000 rpm)；浓缩用离心管Centriprep-30 (Amicon 4322) 请注意其使用 方法。二、药品试剂胶体 Sephacryl S-300 (Pharmacia)

3、: a.预先以缓冲液 buffer A-150 平衡好， 并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用 量。b.胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的 NaCl以除去非专一性吸附。Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温 度一致标准分子量组合 (Bio-Rad 151-1901)：溶于1 mL 后每组取0.4 mL. 含有 thyroglobulin (670 kD)， bovine gamma globulin (158 kD)， chick

4、en ovalbumin (44kD)， equinemyoglobin (17kD)， vitaminB12 (1350) 三、管柱装填1. 以纯水冲洗玻璃管柱 （以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了 解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以 bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则 可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。2. 依预估量取出 Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡； 将瓶中的胶体上下震荡，使的完全悬浮，但勿产生太多气泡。3. 在管柱内加入约 10 cm 高缓冲

5、液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱， 一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时， 可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约 90 cm。4. 胶体完全沈降后，小心以 buffer A-150 加满管柱，关闭出口，装上顶端 端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。 调整缓冲液瓶高度，使流速约每 五六秒一滴，并设定收集体积为 2.5 mL/tube。5. 胶柱流洗约100 mL 后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上 方的溶液到剩约 1 cm 高，注意勿破坏胶体表面平整； 然后打开出口，使液面 下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。四、样本色析进行1. 以微

6、量移液器或滴管吸取样本 （样本体积不得超过胶体总体积的 3%）， 沿着胶体上方管壁缓慢加入，注意切勿破坏胶体的平整表面！（样本确实体积 mL）2. 打开出口，同时开启部分收集器；当样本完全没入胶体时，关闭出口，缓 缓加入与样本相等体积的buffer A-150，打开出口待其慢慢进入胶体中，如此 重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。3. 暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打 开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6 s 一滴。4. 要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容 易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约 80 管。1. 收集试管，

7、进行蛋白质定量分析以及 GUS 活性测定，并请作图。5. 收集 GUS 活性区，以 Centriprep-30 浓缩至 10 mL 后，加 buffer A-0 稀释至 20mL,再次浓缩至 mL （GF），保留100 “。6. 管柱请再以 buffer A-150 流洗 100 mL 后，小心放置一旁，准备以后进行分子量 测定。五、分子量测定1. 进行分子量测定前一天，请先以buffer A-150流洗100 mL，并检查胶柱 内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。2. 取标准分子量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL （以亲和层析法所得 的 AF 部份），如上法注

8、入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集各分划。请 依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。3. 收集所得，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量 依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出 vitamin B12 的溶离管数。 利用以上数据，可画出分子量与溶离管数间的直线关系，作为分子量判定的标准 校正线。4. 同样的一批分划，请进行酶活性分析（GUS），则可定出酶的溶离体积，对照上述标准校正线，则可求出酶的分子量。六、拆除管柱及保存胶体1. 若管柱长期不用，应当自管柱中取出胶体，以缓冲液清洗后，置冷藏室中 保存，但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧，有时可能不易取出，要

9、有耐 心地以缓冲液慢慢冲出来。2. 胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长，但使用前记得要洗去；再度使用 时，请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒，若有结块而不易打散者，也不要使用。蛋白质的分离纯化方法（1）根据分子大小不同进行分离纯化。蛋白质是一种大分子物质，并且不同蛋 白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分 开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主 要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。（2）根据溶解度不同进行分离纯化。影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比 如溶液的 pH 值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下，不同的蛋白 质

10、因其分子结构的不同而有不同的溶解度，根据蛋白质分子结构的特点，适当地 改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，达到分 离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和 盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。（3）根据电荷不同进行分离纯化。根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白 质的方法有电泳和离子交换层析两类。电泳是在外电场的作用下，带电颗粒（如 不处于等电点状态的蛋白质分子）将向着与其电性相反的电极移动的现象。聚丙 烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳，常用于分离蛋白质。离子交 换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离

11、子与交换剂上的平衡离 子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。（4）利用对配体的特异亲和力进行分离纯化。亲和层析是利用蛋白质分子对其 配体分子特有的识别能力建立起来的一种有效的纯化方法。近年来，亲和层析技 术被广泛应用于融合蛋白的分离纯化上,因为融合蛋白具有特异性结合能力。但 是在实际工作中，很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化，往往要综合几种方法 才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法，要求产品纯度和总回收率 越高越好，但实际上两者难以兼顾。随着生物分离技术的发展、新的生物分离技 术的不断出现，为蛋白质的分离纯化提供了许多新的方法和途径。做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验, 细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导 基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。