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1、高通量测序：第二代测序技术详细介绍-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII在过去几年里，新一代DNA测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋 般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术(next-generation sequencing)，是相对于传统Sanger测序 而言的。Sanger测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是 相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新 一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短
2、DNA片段，然后拼接成一幅完整的图 画。Sanger测序大家都比较了解，是先将基因组DNA片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对 于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP终止的，荧光标记的 产物梯度，在测序仪的 96或 384毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过 检测器时， 四通道发射光谱就构成了测序轨迹。在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固 定的PCR克隆阵列(polony)。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反 应。由于所有的克隆都是
3、系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入 的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅 读片段。In vivo chnmg and aunpificaticntn vitro adaptor UgationCycle sequencing31-. GAC7AGATACGAGCG TGA. .-51 (lompiate)CTGATGeneration ot poJony arrayPolymerase dNTPsLsbekd ddNTPsQ (primer).CTGATCTi .CTGATCTA ,riCTQATGTAT
4、*輕 .CTGATCTATG.CTGAJCTATGC .CTGATCWTGCT 丛土j .CT1.VAVW23.FL1 -d ATP- (W ocker) + FL2-dGTP-(bliocler) + FLSdCTP-fblodcer) + F L4-dTT P- blocker i Fluorescence imaging jn four ohanrels Chemicaily cave labels and twrfijinafca rj iwViotfade.ccm一采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术(Reversi
5、ble Terminator Chemistry)-可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。-具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势-可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控，基因功能，蛋白/ 核酸相互作用)研究-将接头连接到片段上，经PCR扩增后制成Library。-随后在含有接头(单链引物)的芯片(flow cell )上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链 引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥”-经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇-边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理
6、，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记 的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单 个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后， 将这些基团化学切割，恢复 3端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全 被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的 配对末端读长可达到2x50 bp,更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的 因素所影响，如荧光标记的不完全切割。Roche 454 测序技术“一个
7、片段=一个磁珠=一条读长(One fragment =One bead = One read)1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300-800 bp 的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。短的PCR产物则可以直接跳 到步骤 3）。2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3和5端具有特异性）连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文 库。3）一个DN
8、A片段二一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带 了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只 包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染 性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷 贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。5）一个磁珠二一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将
9、PTP板放置在GS FLX中，测序开始。放置在四个单独 的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发 生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在 ATP 硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反 应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化 成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号 实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信 号；由此一一对应，就 可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。rmNt-KL 1Al：二 J生WWW6) 数据分析：GS FLX系统在
10、10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信 息。GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB 的从头拼接和任何大小基因组的重测序。GS FLX系统的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或 GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。这 个过程就可能产生误差。因此， 454 测序平台的主要错误类型是插 入-缺失，而不是替换。ABI SOLID 测序技术a. 文库制备SOLiD系统能支持两种测序模板：片段文库(fragment libra
11、ry)或配对末端文库(mate-paired library)。使用哪一种文库取决于你的应用及需要的信息。片段文库就是将基因组DNA打断，两头加上接 头，制成文库。如果你想要做转录组测序、RNA定量、miRNA探索、重测序、3, 5-RACE、甲基化分 析、 ChIP 测序等，就可以用它。如果你的应用是全基因组测序、 SNP 分析、结构重排/拷贝数，则需要用 配对末端文库。配对末端文库是将基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用EcoP15酶 切，使中间接头两端各有27bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。b. 乳液PCR/微珠富集在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引
12、物，进行乳液PCR (Emulsion PCR)。 PCR 完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上 的模板经过3修饰，可以与玻片共价结合。看到这里，是不是有一种似曾相识的感觉呢？那就对了， 此 步骤与454的GS FLX基本相同。不过SOLiD系统的微珠要小得多，只有1 um。乳液PCR最大的特点 是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR 反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿 物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只
13、含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA 模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模 板扩增 产物。c. 微珠沉积3修饰的微珠沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个 或8个测序区域。SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现 更高的通量。d. 连接测序 这一步可就是 SOLiD 的独门秘笈了。它的独特之处在于没有采用惯常的聚合酶，而用了连 接 酶。SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些
14、探针按照碱基互补规则与 单链DNA模板链配对。探针的5末端分别标记了 CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光 染料。探针3端15位为随机碱基，可以是ATCG四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的 碱基对是表征探针染料类型的编码区，下图的双碱基编码矩阵规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜 色的对应关系，而35位的“n”表示随机碱基，68位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基。2nd Base单向SOLiD测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应。第一轮测序的第一次连接反应由 连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含有均质单链DNA模板，所以这次连接反
15、应掺入一种8碱基荧光探 针，SOLiD测序仪记录下探针第1、2位编码区颜色信息，随后的化学处理断裂探针3端第5、6位碱基 间的化学键，并除去68位碱基及5末端荧光基团， 暴露探针第5位碱基5磷酸，为下一次连接反应作 准备。因为第一次连接反应使合成链多了 5个碱基，所以第二次连接反应得到模板上第6、 7位碱基序列 的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息SmwelampW SoquencelllllllllllllMlllllflllllll丁草.生物通www.eW iotrade,com p5111iiniiiiiiiiiiiinuiniHiniAdaot也 SBC.iiKalemDlcile SeouEncelempbie Sequence几个循环之后，引物重置，开始第二轮的测序。由于第二轮连接引物n-1比第一轮错开一位，所以第二
