酵母单杂交

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1、来，通过对报告酵母单杂交酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而 基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细 胞内的基因表达 调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感以纯化的特定转性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难录因子。酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功 能上独立的DNA结合区(DNA-bindin

2、g domain BD)和转录激活区(Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与 AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋 白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特 异结合区域的蛋白。理论 上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于 筛选一种与之有特异结合区域 的蛋白。(百度百科)酵母单杂交法酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白 质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用

3、于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。酵母单杂交原理:将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(mi nimal promoter, Pmin)上游, 把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活 Pmin启动子使报告基因表达。reporter酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编 码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷 酸序列。酵母单杂交用的cDNA文库用什么

4、试剂盒构建?单杂交文库可以用酵母双杂交试剂盒中的SMART试剂盒来构建用BD公司的酵母单杂交文库构建和筛选试剂盒进行酵母单杂交文库的构建。具 体操作步骤为：在15 mL试管中依次加入如下成分：20吐SMART cDNA、6吐 pGADT7-Rec2（0.5 yg/pL，SmaI-线性化）、5 pg pHIS2-PBEl 钓饵载体、20 吐 Herring Testes Carrier DNA （用前于100 C变性5 min,然后迅速置于冰上）、600 pL酵母Y187感受态细胞，轻轻混匀，再加入2.5 mL PEG/LiAc （40% PEG 3350, lxTE Buffer, 0.1 m

5、ol/L LiAc）,轻轻混匀。30C温育 45 min,每隔 15 min 混合细 胞1次，然后加入160 pL DMSO,混匀后置42C热冲击20 min,每隔10 min混 合细胞1次，反应结束后700 g离心5 min,去掉上清，用3 mL YPD Plus Liquid Medium （BD公司）重新悬浮细胞，于30C, 265 rpm振荡培养90 min, 700 g离 心5 min,去掉上清，用6 mL NaCl （0.9%）重新悬浮细胞。为计算转化效率，取 100 pL分别稀释10倍、100倍、1,000倍的转化液涂布于SD/-Leu、SD/-Trp、 SD/-Leu/-Trp平板上，剩余样品涂布于SD/-His/-Leu/-Trp（含适当浓度的3-AT）平 板筛选阳性克隆，30C培养3 d-7 d。同时转化pGADT7-Rec2-53和p53HIS2作为 阳性对照以及pGADT7-Rec2-53和pHIS2作为阴性对照