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1、金属离子与血清白蛋白的相互作用一、实验目的：测定过渡金属离子对蛋白质功能的影响二、实验原理：金属离子在许多生命过程中发挥关键作用，研究金属离子与蛋白质的结合作 用是生命科学的重要内容，是化学和生命科学研究的前沿领域。血清白蛋白是哺 乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物 质。由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯，从上世纪50年度（国 内80年代末）开始，人们对血清白蛋白与金属离子（和药物分子等）的相互作 用展开了大量研究，以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。许多蛋白质含有金属离子，金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的 作用。在人体基因组编码的
2、蛋白质中，超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离 子；所有酶中，超过40%的蛋白质含有金属离子，它们在生命活动过程中发挥着 各样的生物学功能。许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。目前用于研究金属离子与蛋白质相互作用的研究方法主要有：（1）紫外-可 见吸收光谱法；（2）荧光光谱法；（3）平衡透析法；（4）毛细管电泳法；（5）电 泳法等。（一）紫外-可见光谱法蛋白质通常有3个明显不同的紫外吸收带：（1）210nm以下的吸收来自肽 键的吸收以及许多构象因素；（2）210-250nm为芳香族和其他残基的吸收、某些 氢键的吸收、与其他构象和螺旋相关的相互作用等多种因素；（3）250-29
3、0nm附 近为芳香族的残基，其中酪氨酸残基在278nm（Tyr，260-290nm）附近有强吸收， 色氨酸残基（Trp）在290nm附近有强吸收，而苯丙氨酸（Phe，250-260nm）的 吸收较弱。外界因素如溶剂极性以及pH等会影响吸收光谱。当金属离子与蛋白质结合时，蛋白质或金属离子吸收光谱的强度或者谱带位 置会发生变化，可分为两种情况：（1）蛋白质微扰的金属离子光谱变化，可以推断金属离子的配位环境；（2）金属离子微扰的蛋白质光谱变化，可以推断生色基 微环境及蛋白质结构的变化。通过对光谱的比较分析和计算，可以推断金属离子 与蛋白质的结合情况。若蛋白质的吸收峰增强，则可认为小分子进入蛋白质的疏
4、 水腔，导致肽链伸展，疏水环境下降。单纯的溶剂效应下，峰的蓝移表示原先深 埋于蛋白质非极性区的生色基被暴露于极性溶剂，红移则表示生色基被翻转到极性较小的区域。图1芳香酸的紫外吸收图谱（二）荧光光谱法荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法，具有灵敏度高、选择性 强、用样量少、方法简便等优点。血清白蛋白中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 残基，因此能发出荧光。在通常条件下，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的荧光强度 比为100:9:，因此蛋白质的天然荧光主要来自色氨酸。当金属离子与血清白蛋白 结合后，可引起蛋白质或少数金属离子荧光的改变，由此可进行定性定量研究。 常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合
5、数和结合常数，用共振能量转移法 测定金属离子与蛋白质分子中色氨酸残基之间的距离。1、荧光猝灭荧光淬灭的原因是溶液中淬灭剂分子和荧光物质之间发生相互作用致使荧光效率降低或激发态寿命缩短，特异性的淬灭是由于荧光物质与淬灭物质之间发生了特异性的化学作用所引起的。许多过程可引起荧光猝灭，如：激发态反应、 能量转移、配合物形成和碰撞猝灭。荧光猝灭的机制主要静态猝灭和动态猝灭。(1) 动态猝灭动态猝灭又称为碰撞猝灭，是由于荧光体与猝灭体之间的扩散作用导致的。 假设猝灭为动态猝灭，则按照斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)方程：F0 / F = 1 + Kq t 0 Q = 1 + KD Q计算Kq。
6、其中F0为猝灭体不存在猝灭体的荧光强度，F为加入 猝灭体后的荧光强度，Kq为双分子猝灭常数，Q为猝灭体浓度，t0为猝灭 体不存在时荧光体的荧光寿命，KD为Stern-Volmer常数，KD = Kq t 。当按照Stern-Volmer方程作图得到一条直线时，表明只存在一种荧光体，并 且都是猝灭体可接近的；如果存在两种荧光体，则按Stern-Volmer方程作图会偏 离直线，并且逐渐偏向横轴。即使按照Stern-Volmer方程作图是直线，也并不一 定是发生了碰撞猝灭。(2) 静态猝灭猝灭体与荧光体之间形成不发荧光的基态配合物所导致的猝灭，符合方程F0 / F = 1 + Ks Q，Ks为荧光
7、体与猝灭体之间的结合常数。对于静态猝灭通常采 用Lineweaver-Burk双倒数函数关系，即由上式变形可得F0 / ( F0 - F) = 1 + Kd (1/ Q)，Kd为离解常数，Kd = 1/ Ks，静态猝灭常数就是配合物的结合常数Ks。静态猝灭方程与动态猝灭方程表观上一样，静态猝灭用配合物的结合常数Ks表示，而动态猝灭则用Stern-Volmer常数KD表示。(3) 如何区分动态猝灭和静态猝灭1) 通过荧光寿命计算猝灭常数Kq。生物分子的荧光寿命约为10 ns数量级， 各种猝灭剂对生物分子的最大扩散碰撞猝灭常数约为X1010(L -mol- 1-s- 1)。当Kaq 大于X1010
8、(L -mol- 1-s- 1)时，则认为是静态猝灭。2) 观察温度对猝灭常数(Kq或者Ks)的影响。动态猝灭依赖扩散，升高温 度则导致扩散加快，因此猝灭常数则随温度升高而增大；升高温度会导致配合物 稳定性降低，因此静态猝灭常数随温度升高而减小。3) 观察荧光体的吸收光谱。碰撞猝灭仅仅影响荧光体的激发态，因此动态 猝灭不影响荧光体的吸收光谱；而基态配合物的形成会引起荧光体的吸收光谱不 断变化，则可以判断该体系为静态猝灭。2、福斯特（Forster）共振能量转移当血清白蛋白分子的发射光谱与金属离子的吸收光谱有相互重叠时，通过分 子间偶极-偶极的共振偶合可使能量从色氨酸（给体）转移到金属离子（受体
9、）。 按照福斯特（Forster）共振能量转移理论，可以求出金属离子与蛋白质中色氨酸 残基的距离r，并由r的变化分析其它物质对血清白蛋白构象的影响。给体-受体 间能量转移效率E与给体-受体间距离r和能量转移距离R0存在如下关系：E = 1 F/F0 = R6/（ R06+r6）其中R0是转移效率为50%时的临界距离，R06= X IO-25K2N-4J。式中K2为偶极空 间取向因子，取K2 = 2/3; N为介质的折射指数，取；中为授体的荧光量子产率， 中=;J为给体（蛋白质）的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的光谱重叠积分， 可表示为：J = EF （入）8 （入）入4入/ EF （入）入，F
10、（入）为荧光授体在波长入处 的荧光强度，8（入）为受体在波长入处的摩尔消光系数。303 nm240280320360400440波 K/nm图2芳香酸的荧光发射图谱三、设备与器材（一）设备紫外分光光度计、台式高速离心机、生物制冰机、冰箱、自动三重纯水蒸馏 器、干燥箱、水浴锅（6-8孔）、pH酸度计、离心管、微量注射器（50皿）、分析天平。烧杯、容量瓶、移液管。(二)试剂：Cu(Ac)、FeCl3、牛血清白蛋白(BSA)、过氧化氢、亚硝酸钠、氢氧化钠、氯 化钠、氯化钾、磷酸氢钠。四、实验内容：1、溶液的配制(1) 10mg/mLBSA溶液：200mgBSA溶于20mL磷酸盐缓冲溶液中，4C保存。
11、(2) 准确称取Cu(Ac)和FeCl3,先在烧杯中用少量水溶解，然后转移到容量瓶中 定容，配成2mM,室温保存。(3) 100mM磷酸盐缓冲液：溶于200mL水中，调pH为(大约需要加入浓盐酸 600uL)。(4) 100 m mol/L NaNO2溶液：称取0.69 g NaNO2，先在烧杯中用少量水溶解， 二次水定容至100 mL。(5) 100 m mol/L H2O2溶液：取30% H2O2 皿，加入990皿的二次水中。(6) 1 mol/L NaOH 溶液：称取 8 g NaOH，二次水定容至 200 mL。2、金属离子与蛋白质相互作用的紫外吸收光谱测定试管中固定BSA的浓度为mL
12、，加入不同浓度的Cu2+和Fe3+溶液，使终浓度 分别为0、(X10-5M)，补加相应磷酸盐缓冲溶液。37C恒温水浴中反应 30min。以磷酸盐缓冲溶液做参比，扫描200-400nm范围内的紫外吸收光谱，2nm 取一点。分组1234567BSA (mL)Cu2+ (mL)0缓冲溶液(mL)03、Cu2+-NO2-H2O2和Fe3+- NO2-H2O2体系导致BSA蛋白质硝化的可见光谱测定（1）蛋白质硝化蛋白质硝基化（protein nitration）主要指的就是蛋白质中酪氨酸的硝化反应。酪氨酸中含有酚基，硝化反应也正是发生在酚基的苯环上。如图：HHoMJoh -、NNH2OC9H11NO3C
13、9H10N2O5tyrosine3-nitro-tyrosine含有酚羟基的苯环上所发生的硝化反应可由两种途径得到：一种是硝金翁离子 no2+的亲电取代反应，no2+具有线形结构，亲电性很强：Protein-Tyr + NO2+= Protein-Tyr-NO2+ H+另一种反应途径就是自由基反应，这是更接近生物体系的一种反应形式。自 由基的定义为：“任何包含一个未成对电子的原子或原子团，均称之为自由基”。 自由基具有反应性强、顺磁性和寿命短的特点。当生物体系中自由基产生过量时 就会带来一系列的不良反应，引发一定条件下的病理过程。（2）蛋白质硝化的检测方法最简单的硝基酪氨酸定量检测方法是分光光
14、度法，其原理主要是基于3-硝基 酪氨酸稳定存在，且在280到450nm波长范围有最大吸收。在酸性条件（pH左 右）硝化酪氨酸在430nm有最大吸收，因此可以依据吸收光谱来计算硝基酪氨 酸的浓度。0,0-300350400450500Wavelength （nm）.5.0.5I 1 Oguesqssqv250(3) 、实验方案按照加样表加样后，37C水浴温浴30 min。反应后取2 mL反应液，加入200L 1 mol/L的NaOH溶液，在430 nm处测定吸光度。分组123456BSA（mL）Fe3+（mL）0000Cu2+（mL）0000NO2-（mL）000H2O2（mL）0缓冲溶液(mL)五、实验要求：4人一组扫描得到紫外图谱，并进行简单分析。蛋白质硝化数据作出柱状图形。六、思考题1、测定为什么要在37C下进行2、缓冲溶液的pH为什么要保持在
