蓝藻蛋白的分离与纯化

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1、一、实验目的和要求1、 了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。此 外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗 价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可 以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液

2、中电离所形成的 正负离子NH可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋 白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低 盐浓度各不相同研究表明可用25%（NH4）2SO4饱和度沉淀除去杂质，55%（NH4）2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质， 需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可 以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色 法（Folin

3、-酚法、考马斯亮蓝法等）本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的，含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液 中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与 595nm处吸光值成正比。离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离 子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结 合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与 离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱

4、中被洗脱下来。本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进 行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯 化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝 蛋白的等电点为4.3，在PH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝 蛋白。三、试剂与仪器1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.5）、标准蛋白（0.1mg/L）、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、 0.5mol/

5、LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE 纤维素、奈氏试剂四、实验步骤（一）、藻蓝蛋白的提取及初步纯化1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。具体操作：取螺旋藻粉1g,加入0.01mol/LPH6.5的 磷酸盐缓冲液10mL，充分搅拌混匀。室温浸泡30min-1h后，在-20C和38C之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后， 将悬浮液移入离心管，加入10mL0.01moL/L PH6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min， 4000r/min离心20min，上清 液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵

6、分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4C盐析 30min，然后4000r/min离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min， 4000r/min离心20min，弃 去上清液，离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量 为10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔1h换一次透析液，换3-4次。（二）藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线；2、 样品含量测定；3、计算结果。具体操作步骤如下：取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配

7、置标准蛋白溶液。原本标准蛋 白的浓度为0.1mg/mL。表1-1标准溶液配置 管号 标准蛋白（mL）蒸馏水（mL） 1 0 1 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0混匀此6组试管中的标准蛋白溶液，分别加入4mL考马斯亮蓝G-250,摇匀（充分混匀），室温放置5min后在595nm波 长处别色，以1号试管调零点，得到5组标准蛋白溶液在595nm处的吸光值A595。以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标， 以A595值为纵坐标作图，得到的趋势线即标准曲线。将提取的藻蓝蛋白溶液1mL适当稀释（6-10倍左右），再取0.2mL， 补充水到1mL，

8、同上进行比色操作，得到其595nm处的吸光值，通过标准曲线推算其含量。（三）藻蓝蛋白纯度的测定测 定A620和A280值，纯度可用A620/A280来表示。将上述稀释后的样品，用可见分光光度计，测定其在620nm波长处的吸光值A620；再将样品转出，装入石英比色皿，放入紫外分光光度计，测定其在280nm波长处的吸光值A280。由于藻蓝 蛋白在620nm波长处有特征吸收峰，其纯度可以用A620/A280来表示。因此，根据在可见和紫外分光光度计中得到的数据 就可以推算出提取的藻蓝蛋白样品的纯度。（四）藻蓝蛋白的进一步纯化1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡2、上样、洗脱3、测定纯化的蛋白浓度和纯度

9、，并分别计算回收率和纯化倍数。具体操作：3.测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。具体操作：用三倍柱床体积的0.01mol / LpH6.5磷 酸盐缓冲液平衡。将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱，采用0.01mol / LpH6.5磷酸缓冲液洗脱（含0.4mol /LNaCI）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。流速控制在10d/min,用小试管收集洗 脱液，每管收集2mL （或30滴），收集10-12管（呈现蓝 色的液体内含有目的蛋白）。测定每管样品的A620，横横坐 标洗脱体积、纵坐标A620值，绘制洗脱曲线。合并所有管中的样品，A6

10、20和A280值，计算纯度。然后用0.01mol / LpH6.5 磷酸缓冲液（含0.6mol / LNaCI）洗脱，洗脱下的是藻蓝蛋白。柱料的再生：用0.5ml / LHCl溶液处理柱料，洗2-3倍柱床体积，用水洗至pH6.0,0,01mol / LpH6.5磷酸缓冲液平衡。四、数据处理及实验结果(= UJ：-L.ULLJ17斤标淮蛋T CttiTJrr. 2ri. 4n.氏n. A1. r1a sCM0.40. i. rn2r. 102r. :44a. mA. 410. 593A2EO 1.0 L7表三洗说管藪与A620三诜说管藪与A620管号A620nm10.00 720.02930.

11、16840. 17250. 16060.27570. 36880.44090.500100.419110. 325120. 238紫外可见光谱仪测藻蓝蛋白纯度稀释倍数A280A620A620/A28050.2120.4001.887表四根据数据制作藻蓝蛋白的洗脱曲线r flbu六、思考题1、蛋白含量测定方法有哪些？各有什么特点？（1）、微量凯氏定氮法，（2）、Folin-酚法，（3）紫外吸收法，、特点：操作简便迅速，且不消耗样品（可以回收），低浓度的盐类不干扰测定。（4）、考马斯亮蓝染色法，2、盐析分离蛋白的原理是什么？盐在水溶液中电离所形成的正负离子NH可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水

12、化膜， 还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水 程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%（NH4）2SO4饱和度沉淀除去杂 质，55%（NH4）2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋 白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分 子杂质透析掉。3、离子交换层析纯化蛋白的原理？离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维 素），

13、阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团 或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强 度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。4、藻蓝蛋白的功能有哪些？广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。藻蓝蛋白带有荧光，可用作荧光标记物藻蓝蛋白具有刺 激红细胞集落生成，类似红细胞生成素（epo）的作用；藻蓝蛋白具有补血、调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用；增加体能、 促进红血球增长，能增进机体免疫功能，促进生长发育；藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用；具有很高的营养价值和医 疗价值。藻蓝蛋白作为天然食用色素，它可以改善食品的色泽，不仅能提高食品的档次，而且能增加食品中的功能成份。藻 蓝蛋白是少见的色素蛋白之一。它不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含 量高。藻蓝蛋白是水溶性色素，清亮鲜艳，外观悦目可爱，可作为食品、化妆品的添加剂。七、注意事项1、标准曲线制作 规范、准确，样品含量测定准确；2、藻体细胞要反复冻融3次以上，确保细胞全部破碎；3、注意离心机使用；4、DEAE-纤维素柱层析，洗脱液的离子浓度 严格控制。