细菌的生化鉴定

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1、试验三细菌的生化鉴定试验目的：掌握常用细菌生化鉴定方法和结果判定熟悉细菌生化反应的临床意义，试验仪器：电热恒温培养箱、电冰箱、蒸汽高压灭菌器、超净工作台、电子天平、普通光学显微镜、鼓风电干燥箱、电磁炉、微波炉、生物安全柜等试验材料：菌种：大肠埃希菌培养基：EMB、KIA、葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖试剂：革兰染液试验步骤：1、分离培养：EMB平板制备，并分离划线；2、形态学观察： 菌落形态观察;观察比较三种细菌在EMB琼脂培养基上的菌落有何区别，并加以描述。 菌体形态观察；革兰染色，将三种细菌涂在一张载玻片上，镜下观察细菌形态3、生化鉴定：穿刺接种五糖管、双糖铁4、血清学鉴定：伤寒沙门菌

2、、志贺菌5、结果报告 菌落形态特征描述； 菌体镜下形态画图 生化鉴定结果；以列表形式给出，KIA用-/-或+/-或-/+表示 血清学鉴定结果6、讨论：针对试验出现问题加以讨论。讲解：1、细菌鉴定的基本步骤： 分离培养观察菌落形态特征：大小、湿润度、边缘、特征等。 革兰染色：观察镜下菌体形态特征及染色性。 生化鉴定:不同系均具有各自独立的酶系统，因而对底物的分解力各不相同,其代谢的产物也各异。这些代谢产物又个具有不同的生物化学特征，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种的鉴定无论是应用手

3、工鉴定还是自动化仪器鉴定，都需要通过这些生物化学试验来实现，可见掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。因此依托前两项（特性观察和染色性）的结果，选择特征性的生化试验，是细菌鉴定的必要步骤。 血清学鉴定：在以上结果符合所检定的目的菌时，选择相应的鉴定血清做进一步鉴定菌种。2、培养基成分及原理、接种方法及用途：伊红一-美兰培养基（EMB）:该培基中含有4%伊红和6.5%美兰两种指示剂及0.5%的乳糖和0.5%蔗糖，若被检菌能分解乳糖产酸，使培基的pH下降，则促使伊红与美兰结合成紫红色或紫黑色复合物，并附着于菌落的表面，且使菌落表面带有金属光泽；而碱性环境中二者不结合。故不分解乳糖的细菌其菌

4、落无色。伊红-美兰有抑制G+生长的作用，但粪链球菌除外。该培养基亦是肠道菌的鉴别培养基。接种方法:四区划线双糖铁培养基原理:该培养基中加0.1%的葡萄糖、1%的乳糖及0.4%酚红。细菌分解糖类产酸指示剂可使培养基由原来的红色变为黄色。若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，因乳糖含量少，所以产生的酸量亦少，由于斜面部分暴露在空气中面积大，产生少量的酸又在有O的情况下被氧化，加之细菌利用培养基中含2氮物质，生成碱性产物，失去改变局部酸碱度的作用，故使斜面后来又变红，所以培养基斜面部分由培养初期的黄色变为红色，故观察结果时，斜面部分“不变色”仍呈红色；而在高层中生长的细菌，虽然产生的酸量亦少，因处于相对无

5、O状态，产生的酸不能被氧化分解，故使高层部分培养基仍保持黄色。由于该培2养基中含有Fe2+,若所检目的菌代谢产生HS，则HS+Fe2+反应生成FeS使培养基22变黑。培养基中含有的硫代硫酸钠是一种还原剂，防止培养基中氧化物与HS作2用而影响FeS的生成。该培基是鉴别肠道致病菌的一个非常重要的鉴别培养基。接种方法：由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，先穿刺接种高层部分，退出接种针后直接在斜面上来回蛇形划线（可来回多划几次）。 五管糖：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖。指示剂为0.4%溴麝香草酚蓝。若细菌分解相应的糖产酸，使指示剂由蓝色变为黄色。接种方法：穿刺接种，同样不能直插到底，以防产气时漏掉观察。3、血清学试验：凡符合沙门菌属属者，需做血清血鉴定。取一环相应的血清于载玻片上，再取少量的被检菌与之混合，同时做生理盐水阴性对照。结果判断：数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。注意事项：1、平板倾注量：高度为平板高度的1/3，标记在皿。2、注意穿刺接种用接种针不能穿到管底。3、斜面标记不要标记在管塞上。3、生化反应结果以列表形式报告。KIA结果用+/-表示。