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1、高中组11年级生物化学3人项目重组蛋白IFNGA在大肠杆中的表达与纯化重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化摘要：干扰素Y （Interferon gamma, IFN-丫）是体内重要的细胞因子，能够通 过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免 疫力能功能。目前对于IFN-a、IFN-卩重组表达的较多，而关于IFN-y蛋白的纯 化表达较少.因此，本研究使用PCR方法扩增IFN-y基因，将IFN-y基因分别插入 原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-Y，转化大肠杆菌BL21和 Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-y，SDS-P
2、AGE分析重组表达蛋白。结果 表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-Y；表达产物主要以包涵体形式存在； 经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今 后用于医学和生物学研究中。关键词：干扰素；IFN-y蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；一、研究背景干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是 通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒） 的复制。其类型分为三类，a-（白细胞）型、卩-（成纤维细胞）型，Y-（淋巴细 胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活 力，从
3、而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的 活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。 它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能 等多种生物活性。其中，IFN-y是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱 导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作 用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-y能够提高细胞表面MHC分子的 表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染 细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对 病毒感染的反
4、应，但IFN-y的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的 抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点： 抗增生 作用。这是干扰素能用于治疗多种肿瘤的原因。 抗病毒作用。当我们的机体 感染病毒时，体内会产生大量的干扰素。免疫调节作用。干扰素是天然免疫 的一部分，但干扰素也参与多种特异性的细胞免疫，如增强感染的肝细胞表达被 T淋巴细胞识别的蛋白质，帮助T细胞识别病毒感染的细胞等。抗纤维化作 用。这是为什么干扰素治疗的病人肝纤维化会明显好转。干扰素还有抗新血 管增生、促进细胞凋亡等多种功能。但在治疗慢性乙肝方面，抗病毒作用和免疫 调节作用，以及抗纤维化作用可能是主要的。由于IFN
5、-y能够抑制细胞增生，促进细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，具有 抗病毒及免疫调节活性，还可抑制癌基因的表达，因此引起了人们对其在治疗恶 性肿瘤方面的关注。目前，已有文献报道将IFN-y用于肝细胞癌(Hepatic cellular carcinoma，HCC)切除术后和消融术后，以预防复发，如Nishisuchi等对30例 行HCC根治性术后患者进行长达88周的IFN-y治疗，结果显示，IFN-y治疗 可提高术后患者的累积生存率。Lin等也对行消融术后的HCC患者进行IFN-y 治疗，结果发现IFN-y能够降低肿瘤复发率，提高患者生存率oIFN-y局部用药， 还可治疗暴露性肿瘤，如恶性黑色素瘤、恶
6、性淋巴瘤、宫颈癌等。所以我们对其 进行了分析与纯化，进一步了解其成分和结构，并纯化出有用蛋白进行加以利用。二、研究目的目前对于IFN-a、IFN-卩重组表达的较多，而关于IFN-y蛋白的纯化表达较 少；因此本研究希望通过实验研究，在大肠杆菌表达系统中成功表达IFN-y蛋 白，并利用蛋白纯化技术获得较纯的IFN-y蛋白。三、材料与方法1. 大肠杆菌表达载体构建1.1材料DH5a 感受态细胞(TAKARA)； Antibotics(Sigma)；Restriction enzyme(TAKARA)； DNA Ladder(Novoprotein)； pCold II； 载体(TAKARA)；1.2
7、仪器及品牌PCR仪(ThermoFisher)；水平电泳仪(大连竞脉)；凝胶成像仪(上海天能)；台式离心机(湖南赛特)1.3方法1.3.1 PCR扩增目的基因设计引物，以含目的基因质粒为模板，PCR扩增IFN-gamma目的基因。1.3.2重组表达载体构建经PCR扩增胶纯化获得目的基因，用Nde I和Hind III酶切并胶纯化获得 载体pCold II。目的基因片段与pCold II以Sea mLess cloning方法重组克隆，转 化DH5a感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，并测序。2. 大肠杆菌表达筛选2.1材料XY1 培养基(Novoprotein) ； IPTG(Sigma) ； P
8、rotein Molecular Marker(Novoprotein)；Antibotics(Sigma)； Rosetta pLysS 表达菌株(TAKARA)； Antibodies(Sigma)；2.2仪器及品牌高速冷冻离心机(Beckman)；摇床(上海博彩)；超声破碎仪(宁波新芝)；垂直 电泳仪(上海天能)2.3方法重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株，37C培养至OD600=0.8后，加 IPTG(1mM)，37C诱导 3 h,收菌。SDS-PAGE检测表达。重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株，37C培养至OD600=0.8后，冷却后加 IPTG(0.1mM)，16C诱导过
9、夜，收菌。SDS-PAGE检测表达。重组质粒转化 Rosetta pLysS表达菌株，37 C培养至OD600=0.9后，加 IPTG(1mM)，37C诱导 3 h，收菌。SDS-PAGE检测表达。重组质粒转化Rosetta pLysS表达菌株，37C培养至OD600=0.9后，冷却后加 IPTG(0.1mM)，16C诱导过夜，收菌。SDS-PAGE检测表达。Antibotics(Sigma) ； Rosetta pLysS 表达菌株(TAKARA)； Antibodies(Sigma)；3. 蛋白纯化3.1材料基本无机试剂（Na2HPO4，KC1, NaCl等）（国药化学集团）；透析袋（上海
10、绿叶） 超声破碎仪（宁波新芝）；AKTA purifier（GE）；高速冷冻离心机（Beckman）；垂直电 泳仪（上海天能）Chelating HP（Ni）亲和纯化色谱柱（柱体积1 mL）3.2方法Chelating HP（Ni）柱以 20mM PB，500mM NaCl， pH 7.4 平衡液平衡，平衡后 上样90 mL，然后分别用含20，50，100， 200， 500mM 咪唑的20mM PB， 500mM NaCl，pH7.4的洗脱液洗脱。其中500mM咪唑洗脱流份透析到最终缓冲 液中作为蛋白产品保存。4.成品检测4.1仪器及品牌垂直电泳仪（上海天能）；核酸蛋白检测仪（Eppendo
11、rf）；4.2方法终产品进行浓度，纯度检测合格后按要求分装保存。四、实验结果与讨论4.1表达载体的构建（包括目的基因的扩增，酶切、连接和转化，阳性克隆鉴定）4.11目的基因扩增用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因（506 bp）lOOObp2000bpLanel:IFNma (506b1)20001000750500250100M :D12000DNA Marker图1.目的基因扩增4.12酶切、连接和转化将扩增的目的基因用限制性内切酶消化;连接到相应的空载体；将构建好的载体转入大肠杆菌4.13阳性克隆的鉴定用聚合酶链式反应（PCR）确认正确的构建载体12342000100075050025
12、0100B1 B2 B3 B4 MK A B C DLanel-6: Clone 1-6 (expected product length 600bp)Mk: DL 2000 DNA MarkerPositive clone:1-6Positive clone for sequencing: 1， 6Sequencing correct clone :1， 6图2. PCR鉴定阳性克隆4.2表达筛选（包括表达小试确定最佳的表达条件，放大培养） 4.2.1表达小试1 菌株：BL21（DE3）培养基：LB在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入1 mmollPTG在37C培养3 hLane A:
13、诱导前全菌 Lane B:诱导后全菌Lane C:破菌上清 Lane D:破菌沉淀MK:分子量标记图3. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。4.2.2表达小试2 菌株：BL21(DE3)培养基:LB 600 nm波长光吸收值达到1.0时加入0.1 mmolIPTG在16C培养16 h1DB1 B2 B3 B4 MK A B C DLane A:诱导前全菌 Lane B:诱导后全菌Lane C:破菌上清 Lane D:破菌沉淀MK:分子量标记图4. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达4.2.3表
14、达小试3菌株：Rosetta pLysS培养基：LB在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入1 mmolIPTG在37C培养3 h1120 KIXKD6OKDKD30KD20KD14K.DB1 B2 B3 B4 A MK B C DLane A:诱导前全菌 Lane B:诱导后全菌Lane C:破菌上清 Lane D:破菌沉淀MK:分子量标记从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。4.2.4表达小试4菌株：Rosetta pLysS培养基：LB 在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入0.1 mmolIPTG在16C培养16 hKDB1 B2 B3 B4 A MK B C DLane A:诱导前全菌Lane B:诱导后全菌Lane C:破菌上清Lane D:破菌沉淀MK:分子量标记图6. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。4.2.5放大培养 菌株:BL21(DE3) 培养基:XY1 2升在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入0.5 mmolIPTG在37C培养3 h60KD40KD30KD20KD14KDLane A:诱导前全菌 Lane B:诱导后全菌Lane C:破菌上清 Lane D:破菌沉淀MK:分子量标记MKABC
