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1、气相色谱法测定土壤中性糖和氨基糖含量1. 方法原理中性糖和氨基糖在毗啶-甲醇溶液中，以4-二甲氨基毗啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸 酐发生糖腈乙酰酯反应，所得衍生物可利用气相色谱测定。由于土壤样品成分较复杂，需要较多的 处理过程，本试验采用内标法(内标为戊五醇)，可以有效地消除系统误差和样品损失所带来的误 差，增加实验的精密度和准确度。2. 主要仪器-BEIFEN SP-3420A气相色谱仪，配火焰离子化检测器(FID)，北京北分瑞利分析仪器(集团) 有限责任公司；-AT. SE-30型石英毛细管气相色谱柱(30mX0.25mmX0.25um)i00%二甲基聚硅氧烷；通 用型非极性固定相；
2、热稳定性达到350C；化学键合交联柱，可用溶剂清洗；极性相似于DB-1, SPB-1, HP-1等固定相；符合USP G1, G2, G38指定固定相)，中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术 研究开发中心；-RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；-HP-5016SY型氮吹仪，上海济成分析仪器有限公司；-FreeZone 6 plus cascsdo 型冷冻干燥仪，美国 LABCONCO 公司；-DK-98-J型电子恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司- Allegra 64R TD5A型台式高速离心机，美国Beckman COULTER公司；-DHG-9240型烘箱，上海一恒科学仪器有
3、限公司；- 雷磁PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司。3. 主要试剂8种中性糖标准：核糖(RIB).鼠李糖(RHA).阿拉伯糖(ARA)、木糖(乂丫1)、葡萄糖(GLU)半 乳糖(GAL)、甘露糖(MAN)和岩藻糖(FUC)；均购自Sigma-Aldrich公司；4种氨基糖标准：氨基葡萄糖(GLU-N)、氨基半乳糖(GAL-N)、氨基甘露糖(MAN-N)和胞壁酸 (MUR)，均购自 Sigma-Aldrich 公司；内标：戊五醇(Adonitol)，高纯试剂，Sigma-Aldrich公司；其它试剂：盐酸羟胺(Hydroxylamine hydrochloride )，高纯试剂，Si
4、gma-Aldrich 公司；4-二甲氨基毗啶4-(Dimethylamino) pyridine)，高纯试剂，Sigma-Aldrich 公司； 二氯甲烷(Dichloromethane)，色谱纯，天津市凯信化学工业有限公司；乙酸乙酯(Acetic ether)、正己烷(n-hexane )，均为色谱纯，山东省禹王实业总公司化学试剂厂;无水甲醇（Methanol），色谱纯，天津光复精细化工有限公司；毗啶、三氟乙酸（TFA），均为分析纯，上海中秦化学试剂有限公司； 乙酸酐，分析纯，天津市化学试剂三厂；盐酸，分析纯，白银西区银环化学制剂厂。4.溶液的配制4. 1标准溶液和内标的配制：8种中性糖和
5、戊五醇的浓度均为1 mg.mL-1，水溶液配制；四种氨基糖中除胞壁酸用无水甲醇配制浓度为0.5 mg.mL-1外，其它均为1 mg.mL-i水溶液。4. 2衍生试剂的配制：4 : 1的毗啶-甲醇溶液，含有32 mg.mL-1的盐酸羟胺和40 mg-mL-1的4-二甲基氨基毗啶。5. 标液衍生：氨基糖：吸取用无水甲醇配制的胞壁酸溶液150 ml，用氮吹吹干，各吸取其它三种氨基酸溶液 150 ml,加入到吹干的胞壁酸中溶解摇匀后，进行冷冻干燥，按照6. 2所述方法衍生。中性糖：将配置好的上述水溶液，吸取150ml，直接进行冷冻干燥后，按照6. 2所述方法衍生。同时，对各标样单标按同法进行衍生。6.
6、 土壤样品的处理和衍生6. 1中性糖和氨基糖水解及土壤样品前处理（1）氨基糖。将含有约4 mg有机碳（不少于0.3 mg氮）的土壤样品置于水解瓶中，加入6 mol *L-1 的HCl溶液10 mL，加盖密封水解瓶，在105 C下水解8 h。冷却至室温后，加入100既戊五醇溶液 （内标），振荡摇匀后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干，残余物溶解于20 mL蒸水中，并用0.4 mol L-1 的KOH溶液调节pH值至中性（pH 6.66.8），然后以3 000 r/min离心10 min去除沉淀。上清液用冷 冻干燥仪冻干，残留的固体物质用3 mL无水甲醇溶解，再次离心10 min以除去盐分。将上清液转移
7、至U5 mL衍生瓶中，用N2在45 C下吹干，加入1 mL水。然后再次进行冷冻干燥（8 h以上）。实验 中凡是盐酸参与的水解都采用此前处理方法。（2）中性糖。将含有约4 mg有机碳的土壤样品置于水解瓶中，加入4 mol L-i的TFA溶液10 mL， 加盖密封水解瓶，在105 C下水解4 h。冷却至室温后，加入100 pg戊五醇溶液（内标），振荡摇匀 后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干，残余物溶解于20 mL蒸水中，并用0.4 mol-L-1的KOH溶液调节 pH值为6.66.8,然后以3 000 r/min离心10 min去除沉淀。取出上清液再次旋转蒸发干燥，固体物质 用4 mL蒸水溶解，然后转移
8、到5 mL衍生瓶中，进行冷冻干燥（8 h以上）。6. 2衍生方法向上述衍生瓶中加入300应衍生试剂前述4.2）,加盖密封，在7580 C条件下加热30 min, 其间振荡数次。冷却至室温后，加入1 mL乙酸酐，密封再次加热20 min。冷却后加入1.5 mL的二 氯甲烷。过量的衍生试剂通过以下两步来去除：首先，加入1 mol-L-1 d的HCl溶液1 mL,激烈振摇30 s后，移走上层液体。其次，与上面步骤相同，用1 mL的蒸馏水至少洗涤3次，在最后一次洗涤过程中尽可能去除 水相。剩余的有机相在45 C下用N2吹干后，用400应的乙酸乙酯-正己烷混合溶剂（V/V=1 ： 1）溶 解后转移至进样
9、瓶中，即可进行气相色谱测定。7. 气相色谱分析载气为N2，流速1.2 mL.min-1；进样量为2.0此，分流比为30 ： 1； GC进样口温度为250 C，火 焰离子化检测器（FID）温度为300 C。以峰面积内标法定量。中性糖分析色谱柱梯度升温程序为：柱温175 C，保持4 min；以4Cmin-1的速度升温至225 C， 保持4.5 min；再以30 C-min-1升温至270 。，保持2 min；最后以30 C-min-1的速度升温至300 C，保 持2 min。检测器：火焰离子化检测器（FID）； 300 C色谱柱：DM-1 或 AT. SE-30 （30m X 0.25mm X0.
10、25um）载气：N2；流速-1.2 ml/min进样量：2.0ul；分流比：30： 1进样口温度：250C； FID检测器温度：300C氨基糖分析色谱柱梯度升温程序为：柱温175 C，保持4 min；以3.5r- min-1的速度升温至225 C,保持5 min,再以10 C* min-1升温至270 C,保持3 min；最后以30 C* min-1的速度升温至 300 C,保持2 min。检测器：火焰离子化检测器(FID)； 300 C色谱柱：DM-1 或 AT. SE-30 (30m X 0.25mm X0.25um)载气：N2；流速-1.2 ml/min进样量：2.0ul；分流比：30：
11、 1进样口温度：250C； FID检测器温度：300C主要参考文献：1 张 威，何红波，等.不同水解方法对土壤中性糖和氨基糖含量测定的影响J.生态环境， 15(5): 1067-1071.2 ZHANG X, AMELUNG W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine,mannosamine, and galactosamine in soilsJ. Soil Biology and Biochemistry, 1996, 28(9): 1201-1206.3 Wei Zhang, Hongbo He, X
12、udong Zhang. Determination of neutral sugars in soil by capillary gas chromatography after derivatization to aldononitrile acetatesJ. Soil Biology & Biochemistry 39, 2007, 2665-2669.4 WULF AMELUNG, MARTIN V CHESHIRE and GEORG GUGGENBERGER. Determination of neutral and acidic sugars in soil by capill
13、ary gas-liquid chromatography after trifluoroacetic acid hydrolysis J. Soil Biol. Biochem. 1996，28(12): 1631-1639.5 张威，何红波，张明，张旭东.糖腈乙酰酯衍生气相色谱法测定土壤水解性单糖J. 土壤通 报，2008, 39(4):913-916.6 Guerrant G.O. and Moss C.W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetates derivatives by gas chromatography J. Analytical Chemistry 56 ,1984, 633-638.
