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1、培养基有效期的确认本方案已由下列人员审查并批准文件责任职位签字日期报告者审核者审核者批准者1 .目的：确定日常环境监控、 微生物限度检测使用培养基的有效期。2 .接受标准：2.1 试验用菌悬液每1ml含菌数应小于100cfu o2.2 培养基配制后无菌性检查和营养性检查需符合要求。2.3 培养基的pH值应符合相应培养基的要求。3 .操作程序:3.1 实验仪器及器具：生化培养箱LRH-250A（广东省医疗器械厂，30-35 C , 23-28 C , 20-25 C ）;XG1.DMX-0.36E脉动真空灭菌器（山东医疗器械股份有限公司编号10.0311） ; FE20型pH计（梅特勒）;灭菌生
2、理盐水；移液管；试管；双碟。3.2 验证培养基：硫乙醇酸盐流体培养基TGB德国merk）,大豆酪蛋白消化肉汤培养基TSB（德国merk）,营养琼脂培养基 NA（德国merk）,萨布罗葡萄糖琼脂培养基SDA德国merk）、平板计数培养基PCA德国merk）、远腾琼脂培养基ENA德国merk）、硫酸月桂 醇肉汤LST（德国merk）、亮绿乳糖肉汤培养基BGLBB （国merk）、麦康凯琼脂培养基 Mac.A （彳惠国merk）、大豆酪蛋白消化琼脂培养基 TSA（彳惠国merk）、假单胞菌分离琼脂培 养基PIA （BD）、绿脓荧光素测定用培养基 PAF（德国merk）、绿脓菌素测定用培养基PAP （
3、德国merk）、甘露醇胆盐琼脂培养基（MSA）（德国merk）、澳化十六烷基三甲钱琼脂培养基（CET）（德国merk）、沙门氏菌增菌培养基（RVSB）（德国merk）、木糖赖氨酸脱氧胆 盐琼脂XLD（国merk）、麦康凯肉汤培养基 Mac.B（德国merk）、曙红亚甲蓝琼脂培养基 EMB德国merk）、三糖铁琼脂TSI（德国merk）、萨布罗葡萄糖肉汤培养基 SDB德国merk）、 梭菌增菌培养基RCM德国merk）、哥伦比亚琼脂培养基CA（德国merk）、肠肝菌增菌培养 基EEB-M德国merk）、紫红胆汁葡萄糖培养基 VRBGA1国merk）3.3 试验菌：金黄色葡萄球菌 Staphylo
4、coccus aureus ATCC 6538大肠埃希菌 Escherichia coliATCC 8739沙门氏菌 Salmonella typhimuriumATCC 14028铜绿假 单抱菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027枯草芽抱杆菌 Bacillus subtilis ATCC6633生抱梭菌 Clostridium sporogenesATCC 19404白色念珠菌 Candida albicans ATCC 10231黑曲霉 Aspergillus niger ATCC 164043.4 菌悬液的制备：3.4.1 各取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、
5、铜绿假单胞菌、生抱梭菌斜面培养物一 支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，30-35 C培养24-48小时，其中生抱梭菌需厌氧 培养，取出置2-8C贮存使用7天，每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约 为 10- 100cfu/ml。3.4.2 取白色念珠菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，20-25 C培养 48-72小时，取出置2 8C贮存使用7天。取黑曲霉菌SDA斗面培养物用灭菌生理盐水洗 脱抱子，置2-8C贮存使用7天。每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约10100cfu/ml。3.4.3 菌悬液计数3.4.3.1 无菌操作吸取菌悬液1ml,加入含灭菌稀释
6、剂100ml的三角瓶中，摇匀成10-2稀 释液，同样操作制备10-4和10-6稀释液（必要时也可作更大倍数稀释）。3.4.3.2 每种菌悬液备好二只灭菌双碟和融化好并放至50c的NAW养基和RNAW养基TSA培养基和SDAh养基。3.4.3.3 向双碟内注入10-6稀释液（必要时能够是其它浓度稀释液）1ml。3.4.3.4 向含稀释液的双碟内加入备好的培养基约20ml,迅速振摇混合稀释液和培养基，并放置使凝固成平板，其中生抱梭菌置于厌养袋中。3.4.3.5 翻转双碟置适宜温度培养（金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌、生 抱梭菌30-35 C培养24-48小时，白色念珠菌和黑曲霉菌 20
7、-25 C分别培养2-3天和3-5 天）03.4.3.6 计数平板上的菌落数求出平均值，得到稀释液的菌浓度要求应为含菌10-100cfu/ml,若不在此范围内能够改变稀释倍数，得到含菌符合要求的稀释液。3.5 实验步骤3.5.1 培养基的制备酪陈（胰酶水解）15.0g葡萄糖5.0gL-胱氨酸0.5g硫乙醇酸钠0.5g或硫乙醇酸0.3ml新配制的0.1%刃天青溶液1.0 ml酵母浸出粉5.0g氯化钠2.5g琼脂0.7g纯化水1000ml用1N氢氧化钠或1N盐酸调节pH值，使灭菌后为7.1 0.2 ,分装成100ml/瓶，按试剂标 签说明要求121c高压灭菌15分钟，备用。使用前，培养基氧化层的颜
8、色（粉红色）不得 超过培养基深度的1/5。否则，须经100 C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅 速冷却，只限加热一次，并防止被污染。3.5.1.2 大豆酪蛋白消化肉汤培养基（TSB）胰酪陈15.0g大豆陈5.0g氯化钠5.0g纯化水1000ml用1N氢氧化钠或1N盐酸调节pH值，使其灭菌后pH7.30.2,分装成100ml/瓶，按试剂 标签说明要求121c高压灭菌15分钟，备用。3.5.1.3 营养琼脂培养基（NA）冻5.0g肉浸出粉3.0g琼脂12.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸至完全溶解 用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养
9、基pH值，使其灭菌后pH为7.0 0.2,置121c高压 灭菌15分钟，备用。葡萄糖40.0g陈（肉和酪蛋白）10.0g琼脂15.0g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用 1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH,使灭菌后为5.6 0.2,置121c高压灭菌15分钟, 灭菌前加入氯霉素50mg/L。灭菌后于2-25C贮存。3.5.1.5 平板计数培养基：（PCA）胰酶消化酪蛋白5.0g酵母膏2.5g葡萄糖1.0 g琼脂15.0g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用 1N氢氧化钠
10、或1N盐酸调节培养基pH,使灭菌后为7.0 0.2,置121c高压灭菌15分钟 灭菌后于2-25 C贮存。3.5.1.6 远腾琼脂培养基：（ENA）蛋白陈10.0g磷酸氢二钾2.5g无水亚硫酸钠3.3g乳糖10.0g阿拉伯胶0.3g琼脂12.5g纯化水1000ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用 1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH,使灭菌后为7.1 0.2,置121c高压灭菌15分钟, 灭菌后于2-25 C贮存。3.5.1.7 硫酸月桂醇肉汤（LST）胰蛋白20.0 g乳糖5.0 g氯化钠5.0 g硫酸月桂醇钠0.1g磷酸氢二钾5.0 g磷酸二氢
11、钾1.0 g蛋白陈10.0 g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH,使灭菌后为6.8 0.2,加热煮沸1min,置121c高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25 C贮存。3.5.1.8 亮绿乳糖肉汤培养基（BGLBB）蛋白陈10.0 g乳糖10.0 g干牛胆20.0 g亮绿0.0133g纯化水1000 ml根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N氢氧化钠或1N盐酸调节培养基pH,使灭菌后为6.8 0.2,加热煮沸1min,置121c 高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25 C贮存。3.5.1.9 麦康凯琼脂培养基（Mac.A）17.0g3.0g10.0 g5.0g1.5g13.5g30mg1.0mg1000ml胰酶消化明胶蛋白陈乳糖氯化钠胆盐混合物琼脂中性红结晶紫纯化水 根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸
