转染技术原理及应用

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1、常规转染技术分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者 外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高 水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超 螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结 果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，B半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定 转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。 尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小， 大约1/104转染细胞

2、能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH； 新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到 稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例, 细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法, 电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：转染方法原理应用特点磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附 细胞膜被细胞内吞稳定转染 瞬时性转染不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷 法带正电的DEAE-右旋糖 苷与核酸带负电的磷酸 骨架

3、相互作用形成的复 合物被细胞内吞相对简便、结果可重复瞬时性转染但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清电穿孔法咼脉冲电压破坏细胞膜 稳定转染 适用性广但细胞致死率咼，DNA和 电位，DNA通过膜上形成瞬时性转染细胞用量大，需根据不冋细胞类 的小孔导入 所有细胞型优化电穿孔实验条件病毒介导法通过侵染宿主细胞将外 源基因整合到染色体中稳定转染可用于难转染的细胞、原代细胞， 体内细胞等逆转录病毒特定宿主细 胞但携带基因不能太大细胞需处分 裂期需考虑安全因素腺病毒通过侵染宿主细胞将外 源基因整合到染色体中瞬时转染 特定宿主细 胞可用于难转染的细胞 需考虑安全因素阳离子脂质体 法带正电的脂质体与核酸 带

4、负电的磷酸基团形成 复合物被细胞内吞稳定转染 适用性广，转染效率高，重复性好, 瞬时性转染但转染时需除血清。转染效果随细所有细胞胞类型变化大Biolis tic 颗粒 传递法将DNA用显微重金属颗 粒沉淀，再将包被好的 颗粒用弹道装置投射入 细胞，DNA在胞内逐步释 放，表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞，纤维原细 胞，淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染转染细胞数有限，多用于工程改造 瞬时性转染或转基因动物的胚胎细胞（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适 用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效

5、率高受到研究者们的青睐。其中树 枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）的转染性能最佳, 但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有 较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质 子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”（proton sponge ）体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰 胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实 验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计

6、更复杂的基因载体时，PEI经 常做为核心组成成分。线型PEKLine PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI （Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细 胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表 明 BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性 也增大。超高分枝的、较柔性的 PEI 衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发 现这种 PEI 的毒性低，但转染效率却较高。GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI

7、与各种含有生理条件下可降解 键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的 PEI 衍生物。聚合物的分枝结构使 得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米 颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降 解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的 转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也 具有重要的意义。影响转染实验的因素转染技术是指将外源分子如 DNA，RNA 等导入真核细胞的技术。随着分子生 物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细

8、胞基因功能 的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学 试验中，其应用越来越广泛。影响转染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和 活性，细胞培养条件，转染的 DNA 或 RNA 的质量，转染方法，转染试剂的选择等。 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。 前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝 数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分 析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于 各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，

9、B -半乳糖 苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中， 也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低 但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合， 通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因）， 潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：1转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在 转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染

10、试剂都会 提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设 计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。2细胞状态 一般低的细胞代数（50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传 代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。细胞培养在实验室中 保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导 致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同 培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。 因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。3转染方法

11、不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂 推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异， 操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最 佳转染条件。（1）细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在 转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。 一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。（2）细胞密度 细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密 度各不相同

12、，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高 或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新 的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳 定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性 而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而 有些多胺或者非脂质体的配方则要求在 40%-80%之间，总之是尽量在细胞最适的 生理状态下转染，以求最佳的转染效果。不同的实验目的也会影响转染时的铺板 密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度， 所以需要选择能够在较低

13、铺板密度下进行转染的试剂。一般转染时贴壁细胞密度 为 50%-90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书。（3）血清 血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞 或者在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损 伤，甚至死亡导致转染效率极低。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主 流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染 效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响DNA转染复合物的形成，但只要 在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以 了，在转染过程中是可以使用血清的。不过要特别注

14、意：对于RNA转染，如何消 除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一 点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切 成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响 细胞生长，因此也会影响转染效率。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。（4）抗生素 细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成 麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对 于真核细胞无毒，但有些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。 这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。目前转染试

15、剂因为全程都可以用有 血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，非常方便，省去了污染等麻烦。（5）氮磷（N/P）比N/P比是转染效率的关键（为了换算方便，一般以DNA/转染试剂质量比表示）， 在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高，之后达到平值，但毒性也随之 而增加，因此在实验之前应根据推荐比例，确定本实验的最佳转染比例。（6）DNA 质量DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引 原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染 复合物的有效形成及转染的进行，但对GenEscort系列转染试剂影响不大。核酸 纯化世界第一品牌德国QI

16、AGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍 2XCsCl梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA质量操心。此外，对一些内 毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除 内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理 想的转染效果。但如果使用GenEscort转染试剂，一般不需要这么高的DNA质量 要求。当使用 GenEscort 转染试剂时，即使采用传统的酚氯仿沉淀方法纯化质 粒，仍然可达到非常好的转染效果，但所用的质粒量比试剂盒纯化方法的 DNA 用量大一些。4载体构建转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转 染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿 主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转