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1、植物抗旱生理指标测定原理及方法生命科学学院杨歌指标测定:一、可溶性糖（蕙酮法）二、脯氨酸三、丙二醛四、叶绿素五、蛋白（考马斯亮蓝法）六、超氧化物歧化酶（SOD七、过氧化物酶（POD八、谷胱甘肽（GSH九、电导率可溶性糖含量的测定问题及质疑:1.目标糖含量:标准曲线是用葡萄糖位标准制作的， 而蕙酮法是测总糖的量，包括己糖、 戊糖，浓硫酸将淀粉、纤维素水解成 的单糖，将总糖得出的OD值代入由单 一糖做出的标准曲线，有一定误差存 在。注：查看所有文献的标准曲线都 是用葡萄糖制作。2.误差分析：(1) 不同糖类与K酮试剂反应的显色 程度不同。果糖最深，葡萄糖次之，半 乳糖、甘露糖较浅，五碳糖最浅造成
2、误差。(2) K酮试剂溶解度较低，非常容易析出，在反应时加入糖的水溶液中， 出现浑浊现象，影响反应进行。(3)介于以上原因，将上清5ml转移至100ml容量瓶定容，稀释程度过大，当 糖含量少的时候，大的误差可能会掩 盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。方案修改意见：1. 首先，做五到六组空白，测试 分光光度计误差程度。2. 增加平行组数，由三组增加至 五组，减少每个样品测试次 数。3. 改变测试样品定容量，由100ml 变为 50ml。1. K酮法1.1原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛 可与蕙酮反应生成 蓝绿色糠醛衍生物，在可见光 吸收峰位62
3、0nm测定对象：几乎可以测定所有的碳水化合物，而且可以测所有寡 糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等(反应液中的浓硫酸可以把 多糖水解成单糖而发生反应，所以用K酮法测出的碳水化合物含量， 实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量)。1.2步骤试剂：(1)浓硫酸；(2)蕙酮乙酸乙酯试剂：K酮 1g加乙酸乙酯至-50ml实验步骤：(1) 称取样品0.1g ,置于研钵中，加4ml ddRO研磨成匀浆, 8ml ddH2O洗涤研钵。(2) 100 C沸水浴10min,冰上冷却。(3) 4000rpm 离心 10min。(4) 取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。(5) 1ml提取液+ 1ml ddH
4、 2O+0.5ml蕙酮+5ml浓硫酸，轻轻 混合均匀，100 C沸水浴10min,冰上冷却。(6) 620nm处测吸光值。1.3计算方法可溶性糖含量 % = C*V/(W*10A6)*100%V为植物样品稀释后的体积( ml) 100mlC为提取液的含糖量(g/ml ) 根据标准曲线计算W为植物组织鲜重量(g) 0.1g问题及质疑：1. 酸性体系下，脯氨酸与前三酮加热反 应后的最终产物为红色，再实验过程 中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2. 经查看文献资料，反应步骤已经是优 化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与 前三酮的反应产物，消除了多余未反 应的前三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂
5、质(如色素)以及PH变化的干 扰。3. 根据前三酮与脯氨酸的缩合反应分 析：PH控制很重要，保(1)反应体系的持酸性环境，否则，反应产物的最大 吸光值并不在520nm=(2)极限干旱材料或者重脱水材料的 脯氨酸含量大，材料干重比新鲜材料 多数倍，加相同量的前三酮，反应程 度应该有所不同。而脯氨酸含量少的 样本，容易受到各种因素的干扰。二、脯氨酸含量的测定1. 前三酮法1.1原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量 可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性 有关。用磺基水杨酸提取植物样品时
6、，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液 中，然后用酸性前三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理， 则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm波长下比色，从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸 的含量。1.2步骤试剂：(1) 25砒三酮：前三酮 0.625g冰乙酸15ml6mol/L磷酸10ml70 C水浴助溶；(2) 6mol/L磷酸：85酸稀释至原体积的 2.3倍；(3) 3咖基水杨酸：磺基水杨酸 3g加蒸偏水至100ml实验步骤：(1) 称取0.1g样品放入研钵，加 5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100 C沸水浴15min;(2) 冰上冷却，4000rpm
7、离心10min;(3) 提取液2ml+冰醋酸2ml+25砒三酮2ml混合均匀，100 C 沸水浴30min,冰上冷却；(4) 加4ml甲苯混合均匀，震荡 30s,静置30min；(5) 以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。1.3计算方法脯氨酸含量( 邱/gFW = X *提取液总量(ml) /样品鲜重(g) *测定时提取液用量(ml) *10%公式中：X-从标准曲线中查得的脯氨酸含量( g)提取液总量5ml测定时提取液用量2ml三、丙二醛含量的测定1. 原理植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂 过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轴合物、脂类过 氧化物、丙二醛、乙
8、烷等。其中丙二醛（ MDA ）是膜脂过氧化最 重要的产物之一，因此可通过测定 MDA 了解膜脂过氧化的程度， 以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA ） 反应产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶哩2,4-二酮（三甲川）， 该物质在 532 nm处有一吸收高峰,并且在 660nm处有较小光吸 收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰，在 450 nm处有一吸收 峰，用双组分分光光度法加以排除。2. 步骤试剂：（1） 10% 三氯乙酸（TCA ）: TCA25g加 ddH2O 至250ml（2） 0.6%硫代巴比妥（TBA ）: TBA0.6g加
9、5%TC/g100ml实验步骤：（1）称取材料0.1g，加10% TCA 2ml研磨至匀浆，再加 8ml进一步研磨；（2）4000rpm离心10min,取上清至新管；（3）2ml 提取液 +2ml 0.6% TBA，混合均匀，2ml ddbbO+2ml 0.6% TBA为空白对照；（4）混合沸水浴15min,冰上冷却；（5）4000rpm 离心 10min；（6）取上清再 532nnx 600nnx 450nm波长下的光密度值。3. 计算方法MmjniTd-g-lFW）=| &45*（遍-%）-0.55以喝卜白3注意事项：1 .可溶性糖与TBA显色反应的产 物在532 nm也有吸收（最大吸收
10、在450 ng ,当植物处于极度干旱 时可溶性糖含量会增高，必要时 要排除可溶性糖的干扰。2 .低浓度的铁离子能增强 MDAWTBA的显色反应，当植物组织中铁 离子浓度过低时应补充Fe3+ （最终浓度为 0.5 nmol - L-1 ）3.如待测液浑浊，可适当增加离 心力及时间，最好使用低温离心 机离心。式中，Vt：提取液总体积（mL 10mlVs :测定用提取液体积（ml） 2mlFW:样品鲜重（g） 0.1g注意事项：(1) 避光。(2) 时间控制，研磨以及放置时间不 宜过长。(3) 叶绿素一定要提干净，以免造成 误差。四、叶绿素含量的测定1.乙醇法1.1原理叶绿素广泛存在于绿色植物组织中
11、，当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a和b,两者均易溶于乙醇、乙酰、丙酮和氯仿。叶绿素的含量测定方法有分光光度法，利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯一比尔定律计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。因此测定提取液在645nm 663nm 652nm波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。1.2步骤试剂：95%醇实验步骤：(1) 称取样品0.1g放入研钵，加3ml 95%乙醇研磨至匀浆，再加7ml 95%乙醇研磨至组织变白，避光；(2) 4000rpm 离心 10min；(3) 取上清5ml定容至25ml;(4) 95%醇为空白对照，在 645nm 663nn 652nm波长下测定光密度值。1.3计算方法D663=82.04Ca +9.27CbD645=16.75Ca +45.6Cb(浓度单位：g/mL)CA= 12.72D663 - 2.59D 645CB= 22.88D645 - 4.68 D 663浓度单位：mg/L)CT = 20.29D645 + 8.02 D 663(Chl(mg/g 叶)=C(mg/L)*提取液总量(L) *稀释倍数/FW ( g)
