译自丁 ournal of Colloid and Interface Science （2011） - 一细胞对硅涂层硒花镉荧光量子点的吸收和其在体内外的亚细胞定位生命科学学院生物工程10-1班刘静译指导教师：李春斌摘要：在生物研究中，量子点（QDs）由于具有良好的光学特性，已经被作为标记细胞引人注 目分子探针工作目的是探索二氧化硅镀硒化镉量子点在细胞内外吸收和其亚细胞定位中可 能的作用体外吸收的硅涂层是新西兰兔脂肪间充质干细胞（RADMSCs）和宫颈癌细胞（HeLa） 使用4,6-2苯基荧光（PAPI）染色后以荧光显微术进行的体外结果显示硅涂层CdSe QDs被 细胞有效吸收并能在细胞内的一些囊泡中显示出强荧光而与其附近的细胞质和细胞核形成 明显区别此后，QDs胞内外的定位和分布研究是以苏木色素染色、再经冷冻组织薄切片（厚 度＜100|J m）和超薄组织切片（＜15|J m）后在荧光显微镜下观察，此法会得到荧光共焦激光 扫描显微镜的最佳效果体内实验结果证明细胞能有效吸收（CdSe） QDs，并且能显示出QDs 在组织内的大体分布总之，这些体内、外的研究结果表明了 QDs在细胞内的聚集、亚细胞 的定位和的分布、及其在生物医学领域中应用前景。
关键词：细胞吸收；共焦激光扫描显微镜；荧光性；HeLa细胞；量子点1简介具有特殊物理和化学性质的纳米材料增大了在药品自我诊断测试中广泛发展新型工具 的机会由于半导体纳米材料或量子点（QDs）具有可标记的光学特性，故可作为一种潜在 的荧光标记，我们正从各个方面对其进行研究⑴与商业可获得的有机荧光染料相比，QDs 不但具有较好的荧光量子产出，而有一定的抗光漂白效果除了发射的波长从可见到近红外 区域是随着其规格或合成物而改变的以外，还显示了高度的多光子吸收共同作用【2,3】具有 高灵敏度和专一性的探针以QDs为基础来发展，可达到能克服有机染料和荧光蛋白的局限性， 在很多研究领域，不管是分子和细胞生物学还是分子成像和药品检测，都具有一定的可行性在生物体内外将QDs作为荧光探针使生命过程形象化的报道已有许多【4,5】在具有肽键， 蛋白质，抗体的官能团化表面，QDs的确显示了高度的生物兼容性，还可以对活体肿瘤进行 快速荧光成像【6-9】由于自身强烈和稳定的荧光性，使得它们形成一个测评纳米材料和生物 系统相互作用的有用模型，所以QDs很容易被检测到并且，QDs还允许更深层的组织成像， 因为它有穿透区域的高度多光子吸收率°QD探针在生物药学成像和医药治疗方面的应用吸引 了各方学者，但是它的用处只局限于体内研究。
近期的报道已经发现QD能使组织内的淋巴结 和血管成像了【10-12】在其他研究中，跟踪注射一个月后，在小鼠的肝脏，淋巴结核和骨髓 中已经显示且保留了QDs，尽管它对细胞核组织的亲和力很低药物动力学研究证明：对静 脉注射散发红色QDs的小鼠具有相对短的18.5h血浆半衰期，但是持久稳固的甚至成增长性组 织集中再分配已经达到28天【14】研究高度荧光的QDs在体内的定位和保留是是临床应用的中 心，因为它对别的有机物保留和迁移的能力对在体内QDs的应用，一个决定性的问题就是纳米材料的铃动力直径尺寸很大的QDs （直径＞20nm）被网状内皮组织体系（RES）高度吸收【15】，减少了它的功效性和灵敏性近年 来，亲水性的QDs （直径＜10nm）凭借对肾脏的清洗时对体系的潜在毒性降到最小这一功效， 在体内应用领域引人注目【16 17】目前，我们已经能够有条不紊地评估体内体外尺寸小于6nm的硅涂层CdSe QDs在细胞内 的吸收，定位和分布我们需要通过各种途径使这些QDs亲水化，而硅包裹的外敷层是最好 的方法之一【18-20】当前报道表明硅壳外敷层有效防止核心组分流失从而减小毒性影响并且 补偿QDs表面的细胞相容性【21-23】。
我们早期的发现已确认CdSe QDs在液态生物条件下具有细 胞相容性和强烈荧光性【24】在最近诸多研究也表明，用氨丙基硅烷作为硅前驱体，通过硅 氧烷壳覆盖剂取代三辛基氧化磷可以使QDs有亲水性新西兰兔脂肪间充质干细胞（RADMSCs） 被挑选为干细胞模型，宫颈癌细胞（HeLa）为癌细胞模型，那是由于它们形象的分布对癌治疗 和别的病症干细胞相关研究很重要理解和控制QDs的生物分布是在体内生物药学应用中最 重要的，因为会影响成像表现（快速性，灵敏性，专一性）体内研究已证实：在静脉注射 硅涂层CdSe QDs后，瑞士实验小鼠患上白化病用光谱仪（ICP-OES）用来测量镉含量以在 小鼠器官中找到QDs的浓度峰值（分布最高点）在QDs定位和分布研究中，已经确定在如肝 脏、肾脏、脾脏这种新陈代谢的主要器官分布最广我们得到的结果有力地表明QDs细胞吸 收，定位和分布图对癌症和其他疾病具有成像应用2材料和方法2.1化学材料由QDs，硅涂层，和三辛基氧化磷（TOPO）,三辛基，氧化镉（CdO），硒粉，十二烷胺， 表面活性剂，氨丙基硅烷（APS）合成的化学材料在西格玛奥德里奇购买，正十四烷基磷酸 （TDPA）从阿法埃莎购买可直接使用，无需深入提纯。
2.2硅涂层CdSe QDs的制备和特性描述QDs是通过以下已发表的方法步骤合成出来的【绳26】把氧化镉（0.067g,0.52mmol）,十 二烷胺（3.8g,20.72mmol）,三辛基氧化磷（2.7g,6.9mmol）和正十四烷基磷酸 （0.40g,1.44mmol）在真空下加热到U300°C，直到CdO完全溶解生成一种透明液体在此温度 下，导入一种含有三辛基（5.2mL）和Se （0.083mmol）的注射混合物晶体生长后，降低反应 温度给外界环境来抑制反应进行用甲醇进行重复沉淀、在干燥的氯仿中重分离硅外敷层已 达到纯化QD，的目的为了把硅覆盖在CdSe QDs上，我们对已报道的操作【20,24】作出如下改良；把氯仿（400 M脱去CdSe QDs的TOPO和APS （0.075g,0.36mM）的混合物在惰气中涡流30分钟在环己 烷中（10mL）添加该混合物和聚乙二醇壬基苯基醚-520 （Igepal CO-520，1.3mL），并在干 燥环境中搅拌30分钟适当加数滴氨水（150p L,33wt%）然后持续搅拌一天用干燥的氯仿 反复清洗，在PBS缓冲液（pH7.3）中重复分离以纯化硅涂层QDs。
把量子点储存在室温下且 定期检测其发射的稳定性、pH和介质中的离子力用日本岛津UV-3101扫描式光度分度计科记录电子吸收光谱；用SPEX-F112X分光荧光计 收集发射光谱在高分辨透射电镜（HRTEM）下观察，一滴纳米颗粒溶液加到铜网包裹的碳里 能致使溶剂挥发可在FEI Tecnai G2 S-TWIN 300kV高分辨率传输电子显微镜下观察到样品 成像2.3材料和动物为了该细胞成像实验，所有化学品和试剂都是从美国西格玛奥德里奇集团购买的使新 西兰兔脂肪间充质干细胞（RADMSCs）和宫颈癌细胞（HeLa ）与5%CO 2共同在存活37 C的细胞 培养基（DMEM ）里，以胎牛血清和抗生素为营养供给用作体内荧光试验的动物试验品（普 通6周大，20~25g重的雄性瑞士小白鼠）取于喀拉拉大学生化实验楼的动物饲养屋动物被 饲养在可靠的无病原体的温度控制在25+1C且食物和水都充足的环境中我们完全按照印 度政府【批准IAEC-KU-9/06/07/BC-AA （8） （ii）】 CPCSEA （管理和监督实验动物委员会）制 度上的道德指导方针来饲养这些实验小动物每周给动物们称重，记录食物和水的消耗量。
2.4荧光显微镜下硅涂层CdSe QDs的体外细胞吸收和的亚细胞定位在盖玻片里培养RADMSCs和HeLa细胞，两天换一次培养基，直到85%的细胞汇集到一起 在PBS （磷酸盐缓冲液）中添加硅涂层CdSeQDs溶液（100nM）后，把这些细胞放在37°下以 5%CO 2温育3小时温育之后，去掉盖玻片，在37°C下用预热过的PBS漂洗三次，之后用3.7% 的多聚甲醛调零，可在DM6000荧光显微镜（德国莱卡公司以20X物镜，300FX对比度来装备的 数字照相机）下观察到荧光细胞成像2.5硅涂层CdSe QDs体内的分布和定位为了研究硅涂层CdSe QDs在体内的细胞定位和分布，在小鼠尾部静脉注射100p L PBS 溶液的QDs （5nM/鼠）利用光谱仪（ICP-OES，最佳则用美国铂金埃尔默公司的5300DV仪器） 可获得QDs在主要器官（肝脏，肾脏和脾脏）分布最高点由于QDs在主要器官中有浓度峰值 （分布最大值），因此以腹膜内注射硫喷妥钠使小鼠安乐死解剖过程为从实验小鼠中剥去 器官样品后用以在荧光下确定分布的扩大2.5.1研究冷冻超半薄切片（15〃m）--在荧光显微镜下为了该步研究，我们用CM 3050S冷冻显微薄片切片机（德国，莱卡）在观察到的15p m 切片下对组织进行凝固和切割。
然后在DM 6000荧光显微镜下，根据标准步骤用轻的微观分 子苏木紫着色剂对这些切片进行染色和观察2.5.2研究超薄片（小于100nm）--在共焦荧光显微镜下为了该步研究，对所有组织以3%戊二醛和0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4）在4C下整夜进 行校正校正过的组织每5分钟需要用0.1M磷酸钠缓冲液冲洗三次，室温下用1%OsO修复一 4小时用以下系列乙醇使修复细胞脱水：30%的10分钟，50%的10分钟，70%的20分钟，80% 的20分钟，90%的20分钟，95%的20分钟，100%的60分钟，然后在丙酮里浸泡30分钟，操作两 次先用1:1的树脂：丙酮（聚乙烯床812）浸泡1小时，2:1的树脂：丙酮浸泡1小时，提取 出渗透物1小时，最后提纯渗透物一整夜为了更好地植入，把组织放置65C烤箱中通宵烘 烤然后用超薄切片机（超薄切片机；瑞典2088超薄切片机®V，斯德哥尔摩，瑞典）把嵌入 块修剪分割，以得到制备好的100nm器官超薄片为了观察到体内细胞成像，这些组织切片 立即在共焦显微镜下检测氩激光器（488nm）被用来在共焦荧光显微镜（卡尔蔡司激光切 片器510变换）下激发QD3结果与讨论3.1硅涂层CdSe QDs的合成和特性根据高温有机金属法制备出包裹着CdSe QDs的TOPO，被彭及其同事报道【25,26】。
这样一 来，得到的点在被发现在非极性有机溶剂中发荧光且较分散并且，这些QDs被硅包裹的外 敷层制成亲水性，它修改了报道过的步骤⑵】，是以氨丙基硅烷作为硅的前体使用分光镜 和穿透式电子显微镜（TEM）观察在水中分散之前及之后的硅烷化过程的细节和QDs胶体性能 的评估，这类论文已经在别处发表【24】当前的工作则是获得能已最大发散至550nm显示良好 旋光性的（图1a和b）及从TEM分析出的所有尺寸小于6nm （图S1）的硅涂层QDs的评估3urtq-osqvWavelength, nmFigure L Absorbance (dashed trace) and emission (solid trace) of silica-coalcd CdSc QDs in PBS buffer (pH 7.3)随着最大吸收率和排放率的蓝色小转变，外敷层提供了一个荧光量子区域的增大这归因于 氨丙基硅烷的氨基官能团和对比于TOPO分子（数据未表示）在QD表面的Cd2两者之间的相互 调节共焦性质的细节和QDs应用在当前研究的特性描述（TEM,EDS,FTIR）都提供于接下来 的辅助信息中（图S2~S5）3.2荧光显微镜下硅涂层CdSe QDs的体外细胞吸收和定位QDs的其中一个突出应用就是细胞内的标记和成像。
近期实验中，我们使用一对典型HeLa 细胞和RADMSCs作为时间函数，来监控体外硅涂层。