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1、河北大学学年论文（课程设计）酱油生产工艺及酱醅中微生物多样性摘 要 通过对酱油的低盐固态发酵工艺与高盐稀醪发酵工艺的比较，研究两种不同发酵方法下酱醪中的菌系组成，如米曲霉，黑曲霉，木霉，酵母菌，细菌的不同组成，研究在不同发酵阶段各菌的代谢状况和不同发酵条件下的优势菌的生存条件和代谢状况，研究添加优势菌后对酱油酿造的影响。关词键：发酵，酱醪，米曲霉，酵母菌，高盐稀醪发酵AbstractIn this paper, it was summarized that the microbes composition in sauce mash of the two different fermentat
2、ion techniques through comparing the low-salt method and the high-salt liquid method of soy sauce production , such as Aspergillus oryzae ,Aspergillus Niger ,trichoderma spp, yeast ,bacterium. The metabolism of different microbes in different fermentation periods was introduced, as well as the livin
3、g conditions of the dominate microbes. The effect of adding advantage microbesto soy sauce on soysauce flavor was also reviewed. ,Keywords: fermentation,sauce mash,Aspergillus oryzae,yeast,high-salt liquid一 前言 酱油是中国传统调味品, 具有色、香、味一体, 五味调和特色, 使用十分普遍。从科学观点分析, 酱油是一种营养丰富的调味品, 含有18 种氨基酸, 其中有8 种人体所必需之氨基酸。这
4、些营养成分中的主要营养成分来源于高蛋白质物料( 脱脂大豆) 和高淀粉原料( 麦皮和玉米渣) , 经微生物长期发酵而成, 色泽红褐发亮, 体态澄清透明, 酱油历来被人们称为天然色素, 烹调着色佳品1。我国酿造酱油分为2 大类：高盐稀态和低盐固态发酵酱油。前者是传统发酵工艺生产的，后者是由速酿工艺生产的。高盐稀态发酵工艺设备利用率低、人工耗费大，发酵周期长，酱油产品香味浓、色泽浅、体态佳。低盐固态发酵工艺操作简便，设备简单，发酵周期短，产品风味一般。以前，我国酱油的生产绝大多数采用沪酿3.042单一菌种制曲，品酱油红色指数偏低、氨基酸态氮含量不高，缺少酯香等。多菌种酿造酱油是酿造调味品行业的一项先
5、进技术，尤其是在高盐稀态发酵酱油中的应用，取得了理想的效果。发酵出来的酱油酱香、醇香、酯香浓郁，营养丰富，富含多种人体必需氨基酸，是不可或缺的调味佳品。近年来许多企业采用多菌种制曲，在改善酱油色泽、风味等方面取得了良好的效果。所以，多菌种高盐稀态发酵酿造酱油颇受人们的欢迎和喜爱2。二本论2.1酱油酿造工艺简介2.1.1酱油酿造工艺简介：酱油酿造工艺分为天然酿造，高盐稀态，低盐固态和无盐高温等工艺3，酱油生产工艺流程：膨化大豆粉碎成2mm，小麦焙炒后粉碎，按膨化大豆:小麦粉:麸皮= 65:25:10 的比例配料，加入1.3 倍的水量，润水60min，于蒸煮机中以0.18MPa蒸煮5min，15m
6、in 内使原料温度降至454。2.1.2 低盐固态工艺与高盐稀醪工艺的比较与分析目前, 国内大多数厂家都采用低盐固态发酵法, 该工艺蛋白的利用率较高,操作简便, 设备简单, 发酵周期较短, 产品风味一般,可生产普通酱油。随着高品质酱油需求增大, 近些年来出现了许多高档酱油生产厂商,其中石家庄市珍极酿造厂与日本合资, 借鉴日本高盐稀醪发酵新工艺, 生产高档珍极酱油, 该工艺生产线自动化程度高, 产品风味好, 但设备投资大, 生产周期长, 因而生产成本高, 两种工艺的比较见表1:52.2 多菌种制曲:为提高酱油风味，采用多菌种制曲或发酵是最常用的手段。比较常用的菌种除了米曲霉，还有AS3.350
7、、红曲霉、酱油曲霉及其他霉菌。 2.2.1 米曲霉与黑曲霉双菌种制曲目前国内外在制曲过程中常用的菌种是沪酿3.042米曲霉和AS3.350 黑曲霉。1979 年李大锦等试验酱油制曲中添加20%的AS3.350 黑曲霉、80%的沪酿3.042 米曲霉，使成曲的酸性蛋白酶活力提高超过2 倍，酱油发酵后添加AS3.350 黑曲霉的酱油谷氨酸含量比对照组提高超过30%，明显改善了低盐固态发酵酱油风味。毋瑾超等通过试验得出2 种菌制曲温度为30，制曲时间为35h，米曲霉和黑曲霉配比为3:1 时作用效果最佳，此时，曲料的曲酶孢子数为8.66109 个/g，蛋白酶活力可达2588U/g。2003 年李琴等采
8、取AS3.951 和AS3.350 混合制曲的生产性试验表明，酱油风味比单一米曲霉生产酱油风味明显改善，全氮利用率提高10%，氨基酸态氮生成率提高5%左右。SUGIYAMA S在1984 年对酱油酿造中常用的菌种进行了研究，发现米曲霉和酱油曲霉混合制曲能产生较多的蛋白酶和淀粉酶，可提高原料利用率。1994 年UEKI T 等采用Aspergillus oryzae K2 和A.oryzae HG混合制曲（这种混合曲具有较高的产谷氨酸活性（5.5U/g干基），然后加入浓度为23%的盐水发酵180d，谷氨酸的含量是传统的单一菌种制曲方法1.25 倍。2.2.2 米曲霉与其他菌多菌种制曲为了解决制曲
9、酶活力不全导致发酵过程中糖化力、酯化力和增色能力不足、原料利用率不高的问题，研究人员在单菌种和双菌种制曲的基础上，利用更多的菌种制曲。邹镜铭以沪酿3.042 米曲霉、沪酿3.350 黑曲霉、沪酿3.986 红曲霉采用分开制种曲、混合制大曲、低盐固态发酵、酿造特级酱油的新工艺进行了研究。对加入和未添加AS3.986 红曲霉、AS3.350 黑曲霉的2 个批次的低盐固态酿造酱油进行比较，发现前者酱油色泽可提高40%左右，氨基酸态氮提高15%左右，还原糖含量提高30%左右。马净丽以沪酿3.042 米曲霉为参照，从9 种参试菌株中挑选出2 株（分别属于酱油曲霉和黑曲霉）性能互补、能提高酱油产量、质量的
10、优势菌株。2006 年姚继承等利用现代生物工程技术，筛选、遗传诱变、纯化出的复合菌种，具有较强的糖化力、酯化力和增色力，明显改善了产品的口感、色泽、香味。另外，李大锦等也试验酿醋糖化曲AS3.324 甘薯曲霉、AS3758 邬氏曲霉和东酒一号参与酱油制曲，这些糖化曲除了有较强的蛋白酶活力，其分泌的酸性蛋白酶也相当于AS3.350 黑曲霉。2 种或2 种以上菌种制曲的原理：酱油的发酵过程处于偏酸性条件下有利于酸性蛋白酶发挥作用。黑曲霉代谢酸性蛋白酶活性较强，可以弥补米曲霉分泌的碱性蛋白酶在酸性环境下失效的作用。黑曲霉所产的酶类较多，生成的风味成分也较多，加强了原料蛋白质的分解。红曲霉可提高酱油色
11、泽、酱油红色指数，使酱油色泽鲜艳红润、清香明显、鲜而后甜。其他菌的添加都是为了增加酶类的丰富性，促进原料中蛋白质和淀粉的分解，增加风味物质的形成，改善酱油品质。2.3微生物类型及变化产酶特点2.3.1细菌变化情况据中科院微生物研究所介绍，分离酱醅中的微生物共得到细菌6个属，14个种，它们之中有的是有益的，有的是有害的。1 、芽孢杆菌群、好气性， 能形成芽孢耐食盐1315。枯草菌在酱醅中不能繁殖，营养细胞消失，只以芽孢存在，在酱醅中不表现生理活性。但在下料后到成熟期间，都能检出一定数目。2、小球菌群、好气性，生酸力弱，能耐1518食盐。由于好气在酱醅中不能繁殖，而且很快死亡，死菌体是醪汇混浊之一
12、。表皮小球菌的类缓菌株，耐食盐性强，能生酸。大量繁殖会使酱醅PH值下降，破坏中性蛋白酶，降低蛋白质利用率。3 、链球菌群嫌气性， 生酸力比小球菌强， 能耐710食盐。在酱醅中不能繁殖，逐渐死灭。如果在发酵初期大量繁殖，致酱醅PH值下降，抑制嗜盐足球菌的早期生殖也破坏了中性蛋白酶。4、四联天菌能耐20食盐，在酱醅发酵后期，出现在酱醅中，能产生一定量的乳酸 5、嗜盐足球菌在18食盐含量中繁殖很好，发酵初期开始繁殖，到发酵中期繁殖旺盛。它同酵母联合作用能赋予酱油特殊香气。据测定它在酱油中的数量可高达10个/g，且使酱油中的乳酸含量达到15mg/ml,酱油质量较好。如果它的含量少于10个/g，乳酸含量
13、公0.5mg/ml,酱油质量不好。2.3.2酵母菌的变化情况据中科院微生物研究所介绍，从酱醅中分离得酵母7个属23个种：这23个种酵母在酱醅中鲁氏酵母占总数的45，说明它是酱油酿造中的主要酵母菌。它同细菌中的嗜盐足球菌联合作用，能赋予酱油特殊香气，还有易变球拟酵母和埃契氏球拟酵母，也是酱油酿造中形成香气乙基苯酚的酵母菌。它们所不同于鲁氏酵母的是在酱醅发酵的后期才出现。为了提高酱油的质量及缩短发酵期，可以在酱醅中添加嗜盐足球菌和鲁氏酵母菌6。 2.4优势微生物生存特点，生存条件，产酶特色，代谢特征及发酵中作用2.4.1耐盐酵母发酵性能耐盐酵母和耐盐产酸酵母的混合比采用L9 （ 23）正交试验确定
14、，结果是耐盐酵母耐盐产酸酵母为21。以海藻酸钙为包埋载体固定混合酵母，在高糖培养基中发酵，并与游离混合酵母的发酵性能进行比较，发现游离混合酵母耗糖速率比固定混合酵母的慢，但发酵到12d时，两者的耗糖量变得比较接近，固定化混合酵母的残糖量为4.98%（w/v），游离混合酵母的为5.42%（w/v）。固定化混合酵母在生酱油培养基和麦芽汁培养基中的发酵性能基本一致，固定化混合酵母若用于酱油生产的强化酒精发酵，增加酱油香气和改善酱油滋味，从经济的角度考虑，以发酵10d为合适。固定化耐盐混合酵母的耗糖、产醇和产酯能力相对于游离酵母都有所提高7。2.4.2生香酵母在酱油酿造中的应用生香酵母在酱油酿造中的应
15、用酱油酿造是以微生物生命活动为基础的变化过程，原料中各种物质在微生物分泌的各种酶系催化下，水解、发酵而生成产品。因此传统酱油酿造涉及的微生物种类相当复杂，通过不同微生物的代谢途径生成不同的代谢产物和微生物自溶后释放出来的物质，相互之间组合和多级转化，构成了丰富的酱油成分。据日本横冢保的研究，酱油的香气成分约有300 种，可分为脂肪族化合物和芳香族化合物两大类，主要是羰基、醇类、酸类、酯类、酮类、酚类和含硫化合物等。虽然目前已知道微生物特别是酵母菌对酱油酿造过程中风味物质的形成起到重要的作用，但由于风味物质的形成过程非常缓慢，目前仍了解甚少8。2.4.3酵母和乳酸菌在酿造酱油中作用酱油风味与酵母、乳酸菌等耐盐微生物有着密切的关系。据报道耐盐性鲁氏酵母和球拟酵母能在较高食盐浓度下繁殖, 在无盐条件下反而不能生长, 在酱油发酵中产生乙醇等醇类、醛类等香气及呈味的琥珀酸等; 硝酸同化性的球拟酵母能生成微量的4 - 乙基愈创木酚及对乙基苯酚等(酱香的主要成分之一) 酵母菌体自溶产生呈鲜味的核酸类物质。乳酸菌适度繁殖使pH 下降至510 左右适宜酵母菌繁殖。适量的有机酸和醇类形成相应的酯类。醇、醛、酯、有机酸等是构成酱油风味的主要成分。但乳酸菌大量繁殖, 产生过量有机酸, 使pH 迅速下降会抑止酵母菌繁殖、产生拮抗作用9。
