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1、【关键字】设计荧光量子点法降钙素原(PCT)试剂盒的研制学院专业 指导老师 班级 姓名 学号 摘要本产品运用免疫层析法的夹心免疫技术将量子点与PCT单克隆抗体结合， 建立一种新型的免疫分析法进行特异性定性检测人血清或血浆中的PCT，使灵敏 度显著提高，达到或超过某些酶联免疫吸附法(ELISA)的水平。由于待检测PCT 与 PCT 抗体的反应，使得水溶性量子点的荧光强度产生变化，通过测定水溶性 量子点荧光强度变化的量来实现对待检测PCT浓度的高选择性定量检测。本发 明中的降钙素原(PCT)检尝试剂盒具有制备低廉、稳定性好、易于保存，利用荧 光量子点标记方法检测灵敏度高、特异性强的优点，比较容易的
2、在临床进行推广。1.研究背景目前临床和科研实验室中均用免疫学方法检测PCT浓度，包括胶体金法、 ELISA法和免疫化学发光法等。所有这些方法的前提都是制备PCT特异性抗体, 且健康人血浆中含量极低，在200pg/mL以下，对抗体的亲和力等参数要求很高。 迄今为止这些检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。因此，制备 PCT特异性单克隆抗体，为PCT的免疫检测提供具有自主知识产权的关键原料, 对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。目前应用化学发光免疫分析技术建立人血清中降钙素原定量检测方法，采用 固相包被降钙素原单克隆抗体，生物素标记另一降钙素原单克隆抗体 ，建立人 血清中降钙素
3、原的双抗体夹心化学发光免疫定量检测方法。在此基础上，荧光免 疫分析技术是利用荧光物质标记抗体或者抗原分子，通过与待分析物的特异性结 合后，检测荧光信号的强度变化，实现对目标分析物的定性和定量检测。制备荧 光信号强、免疫活性好的量子点-抗体(QD-Ab )复合物是将量子点应用于荧光 免疫检测的关键。QD-Ab的荧光信号放大效率主要是由量子点一抗体偶联比例 以及量子点本身的荧光量子效率决定，而其免疫活性则由QD表面偶联的抗体分 子的量效决定，除了抗体自身亲和力对复合物的免疫活性产生影响外，抗体与量 子点间的偶联位点和抗体分子在量子点表面的空间构象也对QD一Ab复合物的免疫活性有重要影响。2.PCT
4、 简介及临床意义PCT （降钙素原，procalcitonin）是一种无激素活性的降钙素前肽物质，来 自于定位11号染色体上的单拷贝基因，该基因由 2800个碱基对组成，含 6 个外 显子和5个内含子，相对分子质量约为13x103。在正常代谢下，甲状腺C细胞 产生PCT并分泌激素活性的降钙素。正常人血中PCT浓度极低，当严重细菌、 真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。在自 身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高；局部有限的细菌感染、轻微的感染 和慢性炎症也不会导致其升高。自1993年Assicot等首次报道PCT可作为细菌 感染的早期标志物以来,PCT作为一个新的
5、炎症指标广泛应用于细菌感染的诊断 与鉴别诊断，2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT作为诊断指标 之一。PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征（SIRS）和多器 官功能紊乱综合征（MODS），即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些 病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。从肠道释放细胞因子或细 菌移位可能诱导其升高。PCT是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个参数。它的 测定可以作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。3.量子点技术简介及研究进展量子点（quantum dots，QDs）是纳米尺寸的半导体微粒，又称为半导体纳 米晶体（nanoc
6、rystals，NCs），是一种由IIW族或IIIV族元素组成的、稳定 的、溶于水的、直径在210nm之间的纳米晶粒。当半导体材料减小到纳米尺 寸时，它与大块材料相比具有独特的光学特性。目前，量子点最有前途的应用领 域是在生物体系中作为荧光探针。QD的光学特性比传统的荧光染料探针有明显 的优越性：（ 1 ） 量子点被激发后可得到波长范围宽且光谱可调的荧光。（ 2 ） 量子点粒径大小不同，所激发的荧光也不相同。（ 3 ） 不同大小的量子点可以用同一波长的光激发而发出不同颜色的光，这将给生物 学的研究带来很大的方便。由于量子点半峰宽较窄，这就允许使用不同光谱特征的量子点， 而发光色谱不发生重叠或重
7、叠较小，可用于多种标记物的同时检测生物体内的几种组分。量子点具有很多的优点，如能解决量子点与生物分子的偶联问题，就可以用 量子点代替有机荧光染料，在细胞器定位、信号传导、原位杂交、胞内分子的运 动和迁移等研究中发挥巨大的作用。量子点的制备方法有很多，用于生物荧光探针的量子点通常采用胶体化学法按所用的原料不同可以分为金属有机溶剂热分解和巯基分子作稳定剂的水 相合成两种路线。对用于生物检测的纳米晶体的要求是可溶于水或缓冲溶液，粒 径分布均匀，量子产率高，并且稳定。因此制备发光效率高、发光颜色可调性好、 对光热稳定性好的量子点，尤其是制备对于生物检测十分重要的受激发能在红外 区发光的量子点已成为近年
8、来的研究热点。量子点作为荧光探针使用时，其表面需要修饰生物分子，如抗体、多肽、糖 类等。如何将生物分子有效的偶联在量子点表面并保持其生物活性，是量子点生 物学应用中极为关键的一步。到目前为止，已经有一些类型的偶联技术在量子点 抗体偶联中应用。量子点的制备方法通常分为物理方法和化学方法两种。用于生物探针的量子 点的合成方法主要采用胶体化学法，通过在胶体溶液中进行纳米晶体的制备，一 类是在高沸点的有机溶剂中利用前驱体（烷基（非）金属）热分解来合成，另一 类是利用稳定剂（巯基小分子）在水溶液中合成。采用胶体化学法在有机溶剂中 合成的量子点在用于生物标记时必须对量子点进行表面修饰，使其具有一定的水 溶
9、性和生物相容性，同时在量子点表面连接上可与生物分子连接的功能性基团， 可引入极性的官能团（如氨基或羧基等），再通过交联剂NHS （N-羟基琥珀酰亚 胺）或EDC （乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亚胺），完成量子点与生物大分子（蛋 白质、核酸、酶等）的共价偶联。目前量子点标记最为活跃的领域是在荧光免疫方面。借助于抗原抗体、生 物素一亲和素等之间的特异性识别作用完成各种研究。QDs稳定性好，荧光杂质 少，连接于生物分子后不影响其活性，特异性高。4.产品技术及待解决问题本项目参考CN1A中的方法将降钙素原检尝试纸，作为一种量子点标记免 疫定量检尝试纸，包括底衬以及依次搭接地粘贴于底衬上的样品垫、过滤
10、垫、结 合垫、层析膜和吸水垫从而形成多层膜结构，各层膜结构之间部分重叠；所述结 合垫上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、以及量子点标记的兔IgG； 所述层析膜上有一条包被降钙素原特异性抗体II的检测线、以及一条包被羊抗 兔IgG抗体的质控线。该试纸可方便快捷、准确定量地同时检测降钙素原。本发明同时参考一种降钙素原的化学发光定量检尝试剂盒及其制备方法和 检测方法，用以巯基丙酸（MPA）作为稳定剂合成的水溶性量子点CdSe纳米粒 子，用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将量子点活化，用EDC （乙基-3-（二甲基氨 丙基）碳二亚胺）完成量子点与PCT抗体的共价偶联。CdSe量子点表面覆盖有 巯基乙
11、酸，在水溶性缩合剂EDC的作用下与抗体的氨基反应，使抗体以共价键 连到量子点表面。用修饰过的QDs标记单抗，而此标记不影响PCT单抗与多克 隆抗体的反应，标记后的PCT抗体仍然具有生物活性。EDC与羧基反应形成氨 基反应活性的中间体一O-酰基脲，该中间体很不稳定，在水中会很快水解释放出 羧基，以及一 N-酰基脲。该副反应所产生的N-酰基脲会结合在蛋白疏水区域的 羧基上，而NHS介入的反应，可以使形成的中间体在水溶液中保持稳定。整个 偶联过程简单，条件温和，量子点的荧光强度几乎不受影响。偶联过程中，会有 小部分量子点和抗体发生交联，生成大颗粒物，反应后离心即可去除。降钙素原测定试剂盒（荧光量子点
12、法）项目设计方案1 设计目的和依据：目的：本发明目的在于提供一种利用荧光量子点法定量检测降钙素原（PCT） 的试剂盒， PCT 作为一种能直观反映全身炎症反应的活跃程度的蛋白而备受关 注。目前市场上运用荧光量子点法检测降钙素原（PCT）的产品较少，而该种方 法相较于其他化学检测方法拥有更加灵敏准确的优势，相较于其他物理检测方法 也有着对设备加工工艺要求较低的优势。依据：专利：1 、CN2 、CN3 、CN4 、CN5 、CN6 、CN文献：1 宋健,范佳,宋大千,毕丽荣,周广宇,张皓,魏景艳,杨柏. 量子点偶联抗体型夹心 免疫传感法检测心肌肌钙蛋白 IJ. 高等学校化学学报,2009,10:1
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