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1、罗丹明6G-Mn2+-H2O2体系荧光分光光度法测定水果的抗氧化活性一前言：羟自由基(0H)可以电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作 用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。羟自由基还与衰老、肿瘤、 辐射损伤和细胞吞噬有关。对机体适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性物 质恢复到一定水平的药物，可改善这些状况。由于长期使用化学合成的抗氧化剂 对人体有一定的副作用，所以，寻找天然、安全、无毒的抗氧化剂就越来越受到 人们的重视。二,测定原理 传统的Fenton反应是用Fe2+-H2O2体系产生羟自由基。本文研究发现，Mn2+ 亦可与H20作
2、用，类似Fenton反应产生羟自由基，产率比FeSO4还要高，其反 应原理可类推如下：Mn2+H 202Mn()+ 0H+ OH-Mn(III)十 H2O2Mn(IV)+ OH + OH-然后，利用羟由基迅速氧化罗丹明6G，使罗丹明6G的荧光强度显著降低，降 低程度随羟自由基的增加而加大，从而间接测定羟自由基的产生量。而水果提取 物可以部分清除溶液中的羟自由基，从而使其荧光碎灭程度减弱，据此可以测定 水果抗氧化性。三主要仪器与试剂3.1.1主要仪器分子荧光分光光度计 台式离心机实验室pH计 主要试剂99.7%)MnS04 H20多功能食品加工机 电子分析天平3.1.2(含量不少于99%)99.
3、5%) 为蒸馏水。罗丹明6G氨水(含量不少于25%-28%)抗坏血酸(含量不少于氯化铵(含量不少于所用试剂均为分析纯，水3.2储备液的配制干燥的小烧杯若干，1L容量瓶1只，100 mL容量瓶3只，1000 mL的容量瓶, 塑料瓶，500mL容量瓶两只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只。2mL移液 管 4 只，贴上标签(罗丹明 6G，Mn2+, H2O2, buffer。)，100ml 量桶(H2O2)， 10mL移液管3只(缓冲)321硫酸锰储备液的配制 准确称取 MnS04 H2O0.3397g,在小烧杯中用少量水溶解转移100 mL容量瓶中定容，配 制成20 mmol/L溶液作为储
4、备液。实验所用的浓度是2 mmol/L，移取10mL20 mmol/L储备液于100 mL的容量瓶中定容至刻度。322罗丹明6G储备液的配 制 准确称取罗丹明6G 0.01 g，在小烧杯中溶解，转移定容在1000 mL的容量 瓶中，配成1X10-2 g/L的储备液。323 1%双氧水储备液的配制 准确移取30% H2O23 mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87 mL的蒸馏水。324氨水储备液的配 制 准确移取3.33 mL浓氨水，稀释至500 mL的容量瓶中，定容至刻度，配制 成0.13 mol/LNH3H2O的储备液。3.2.5氯化铵储备液的配制 准确称取2.6855 g氯化铵，在小烧杯中用少量
5、 水溶解，转移定容在500 mL的容量瓶中，配制成0.1004 mol/LNH4Cl的储备液。3.2.6 根据化学手册配制成不同pH值0.1mol/LNH3 H20-0.1004mol/LNH4Cl 的缓冲溶液：NH4Cl V/mL 32 32 30 2515 NH3 H2O V/mL 1 4 15 25 30 pH 8.0 8.58 9.19.59.8 10mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！3.2.7抗坏血酸储备液的配制准确称取抗坏血酸0.3523 g，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在100 mL的 容量瓶中，得到20 mmol/L的储备液。实验时，移取2.5 mL20 mm
6、ol/L的抗坏血 酸，转移定容在100 mL的容量瓶中得到0.5 mmol/L的抗坏血酸。3.3实验方法3.3.1羟自由基的测定 在10 mL容量瓶中，pH 9.5的缓冲溶液1.0 mL，加入1 X10-2 g/L 的罗丹明 6G 1.6 mL， 2.0 mmol/L 的 Mn2+ 溶液 1 mL，1%的 H202 溶液0.8 mL，加蒸馏水至刻度，混匀。测定542 nm波长处的荧光强度F，计 算其与空白参比(罗丹明6G与缓冲液)荧光强度F0之差 F，通过测定OH形 成前后罗丹明6G的荧光强度变化，来反映OH的产生量。3.3.2羟自由基清除率的测定 在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂，同
7、样操作侧定荧光强度Fs；罗丹明6G和缓冲溶液作为空白体系，其荧光强度为 F0，未加清除剂的体系，其荧光强度为F，贝U清除率=(Fs-F)/(F0-F)X100%3.3.3水果水提取物清除OH的作用 新鲜水果洗净，晾干，准确称取40 g， 加入200 mL蒸馏水，匀浆3 min，过滤，离心5 min，取上层清液0.6mL按上述 方法进行测定。四结果与讨论4 4.1.荧光光谱 罗丹明6G本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长 分别为350 nm和542 nm，图1同步荧光分光光度法测得的荧光光谱4.2实验参数工作模式：发射扫描扫描间隔：2 nm 激发狭缝：6 nm 发射狭缝:6 nm负高压：13
8、0 V 4.3实验条件实验条件对羟自由基的产生有影响，也对抗氧化剂对羟自由基的清除率有影响， 应综合考虑这两方面的因素，选择适宜的测定条件。4.3.1酸度的影响空白和羟自由基体系的AF受pH值的影响如图2所示。可以看出，在范围内，AF有较大值，故选用弱碱性介质pH的缓冲溶液。(注意溶液加入顺序) 序号缓冲各lmL(pH=) 8.0 8.58 9.1 9.5 9.8罗 丹明 6G(1X10-2 g/L) /mL 11111 Mn2+(2.0 mmol/L )/mL 11111 H2O2(1%)/mL 0.80.80.8 0.8 0.8罗丹明6G +缓冲溶液罗丹明6G +缓冲溶液+Mn2+H2O2+水果提取物罗丹明6G +缓冲溶液+Mn2+H2O2.5抗氧化剂清除羟自由基作用的测定于体系中加入抗坏血酸，按试验方法测定空白体系的F0,OH体系的F,加 清除剂体系的Fs。荧光强度变化如图1所示，结果表明，随抗坏血酸用量增加, 清除率加大。说明本体系中抗坏血酸与OH的清除作用有明显的量效关系。4.6 水果的抗氧化作用 测定了 3种新鲜水果的水提取物对OH的清除率，结果见 表2。从表中看出，具有较强的清除OH的功能。F0=70.1 F=26.7 参考文献：兰瑞家2011廊坊师范学院
